精准分析 microRNA 与基因调控，去除 rRNA 干扰，就用它！

01背景

RNA-Seq 已成为分子生物学和疾病诊断研究中的一种关键技术工具，可使研究人员在单次分析中检测基因表达差异，揭示 RNA 结构的多样性，如：可变剪接、融合基因和单点突变。然而，rRNA 通常占总 RNA 的 80% 以上，作为基因组中高度丰富且保守的成分，rRNA 并不能提供有价值的信息。若不去除，这些高丰度的转录本会降低重要转录本的测序深度，并严重干扰低丰度转录本的捕捉，降低分析的灵敏度。因此，RNA-Seq 面临的挑战之一在于去除 rRNA 的同时保留有效转录本信息。去除 rRNA 不仅能更准确地反映真实的转录本状态，还能改善低表达或稀有样本转录本的检测，提升数据质量和分析精度，同时降低成本。

为解决传统去除 rRNA 的磁珠法和酶消法操作繁琐且耗时长等问题，纳昂达推出了 NadPrep^® rRNA 快速封阻全流程解决方案，旨在以更优的成本和简便的操作实现总 RNA 中 rRNA 的快速高效封阻。该方案基于高亲和力寡核苷酸与同源 rRNA 结合的原理，已有基于人 [NadPrep^® rRNA Blocking Reagent (Human)] 和斑马鱼 [NadPrep^® rRNA Blocking Reagent (Zebrafish)] 的成熟目录产品。此外，纳昂达还可针对特定物种或 RNA 序列进行定制设计。NadPrep^® rRNA Blocking Reagent 既可单独使用，也可结合使用，适用于复杂样品中不同物种来源的 rRNA 的高效去除。

02技术原理 & 操作流程

图 1. rRNA Blocking Reagent 封阻原理 (以 Human 为例)。

以人源 RNA 为例，在总 RNA 逆转录前，NadPrep^® rRNA Blocking Reagent 优先与 rRNA 结合，且不影响随机引物和 Oligo dT 与 RNA 的结合。在逆转录过程中，rRNA Blocking Reagent 可阻止靶 rRNA 的逆转录，而非靶 rRNA 可顺利进行，从而达到封阻的效果。

图 2. rRNA 快速封阻全流程解决方案 (双链 DNA 的合成)。

03方案特色

04方案表现

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前期，我们已展示了 rRNA 快速封阻全流程解决方案 (Human) 对人源 rRNA 的封阻表现。此次，我们将从模式生物斑马鱼出发，进一步展示 rRNA 快速封阻全流程解决方案 (Zebrafish) 的性能表现。

针对斑马鱼的 5S、5.8S、12S、16S、18S、28S rRNA，纳昂达推出了 NadPrep^® rRNA Blocking Reagent (Zebrafish)，仅需一步移液操作将 rRNA Blocking Reagent (Zebrafish) 加到反应体系中，并在随后的高温片段化后经过 8 min 的梯度降温反应，即可实现斑马鱼总 RNA 中的 rRNA 的快速高效封阻。

4.1兼容宽泛的 RNA 投入量范围

我们投入 50 ng 到 500 ng 不等的斑马鱼总 RNA 进行测试，利用 NadPrep^® rRNA Blocking Reagent (Zebrafish) 搭配 NadPrep^® 总 RNA 逆转录模块，衔接 NadPrep^® DNA 通用型文库构建试剂盒进行文库构建。结果显示，总 RNA 中的 rRNA 封阻效果在不同投入量下均保持良好，rRNA 残留量均低于 5% (图 3. A)，且不同投入量下的 rRNA 封阻对基因检出数量、转录本覆盖均一性以及基因表达并不会造成显著影响 (图 3. B-D)。

图 3. NadPrep^® rRNA 快速封阻全流程解决方案 (Zebrafish) 应用于不同投入量斑马鱼总 RNA 时的表现。A. rRNA 占比；B. 基因检出个数；C. 转录本覆盖；D. 表达相关性。

4.2无差别衔接第三方 RNA 文库构建试剂盒

为测试 NadPrep^® rRNA Blocking Reagent (Zebrafish) 与第三方 RNA 文库构建试剂盒的兼容性，我们投入 50 ng 斑马鱼总 RNA，利用 NadPrep^® rRNA Blocking Reagent (Zebrafish) 分别搭配 NadPrep^® 总 RNA 逆转录模块衔接 NadPrep^® DNA 通用型文库构建试剂盒、Hieff NGS^® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit (Cat # 12308ES) 以及 Fast RNA-seq Lib Prep Kit V2 (Cat # RK20306) 进行文库构建。结果显示，NadPrep^® rRNA Blocking Reagent (Human) 可有效兼容第三方 RNA 文库构建试剂盒，且未对 rRNA 封阻产生不良影响 (图 4.)。

图 4. NadPrep^® rRNA Blocking Reagent (Zebrafish) 衔接第三方 RNA 文库构建试剂盒应用效果。A. rRNA 占比；B. 基因检出个数；C. 转录本覆盖；D. 表达相关性。

4.3rRNA 封阻与 RNACap 联用提升捕获性能

利用 DV 200 = 22% 的低质量 FFPE total RNA 样本构建预文库，以 NanOnCT Panel (150 Kb CDS region) 分别进行 1 轮 和 2 轮杂交捕获以及利用 NadPrep^® rRNA 快速封阻全流程解决方案 (Human) 衔接 NadPrep^® DNA 通用型文库构建试剂盒进行预文库构建，以 NanOnCT Panel 进行 1 轮杂交捕获。结果显示，针对低质量样本，rRNA 封阻与 RNACap 联用显著提升了 Panel 的捕获性能 (图 5.)。

图 5. 不同 RNA-Seq 技术路线的性能比较。A. rRNA 占比；B. 中靶率。

05应用展望

NadPrep^® rRNA 快速封阻全流程解决方案结合了总 RNA 逆转录模块：NadPrep^® Total RNA-To-DNA Module 和 rRNA 快速封阻模块：NadPrep^® rRNA Blocking Reagent (商品化/定制化物种)，无缝衔接 NadPrep^® DNA 通用型系列文库构建试剂盒，能够快速封阻总 RNA 中的 rRNA，从而用于检测 RNA 样本的基因表达、单核苷酸变异、可变剪切和融合基因等生物学信息。

接下来，纳昂达将陆续推出针对 globin mRNA、大鼠、小鼠及其它常见模式生物的商品化 rRNA 封阻试剂；同时，我们也提供高表达 RNA 区域封阻试剂的定制化服务，以满足特殊应用场景需求。如有需要，请联系我们 (support@njnad.com) 获取专业的个性化建议。