低频突变分析

应用背景

使用二代高通量测序平台（Next generation sequencing, NGS）检测样本中的低频变异，尤其是变异频率低于 1% 时，真实变异容易淹没在样本保存、建库扩增和测序过程中引入的背景噪音中。带有分子标签的接头可对双链分子进行标记并记录其原始状态。数据处理时通过分子标签分析和同源家族（Consensus family）分析可有效排除核酸损伤、扩增错误以及测序错误等环节引入的假性突变。

分子标签靶向捕获分析适用于多种应用场景，如：利用肿瘤病人血浆游离核酸进行肿瘤突变位点的检测，利用怀孕母体血浆游离核酸进行胎儿单基因遗传病的检测，利用尿液游离核酸进行相关突变位点的检测，利用石蜡样本进行肿瘤突变位点的检测，以及利用血液基因组 DNA 进行血液肿瘤微小残余病灶的检测等。

方案推荐

流程图

文库构建

封阻序列

靶向捕获

测序平台

NadPrep^® 血浆游离 DNA 双端分子标签文库构建试剂盒（for MGI）

NadPrep^® NanoBlockers (for MGI)

NanOnCT Panel

定制 panels

MGISEQ / DNBSEQ™

NadPrep^® 血浆游离 DNA 双端分子标签文库构建试剂盒（for Illumina）

NadPrep^® NanoBlockers (for Illumina)

NanOnCT Panel

定制 panels

Illumina

相关产品仅限研究使用，不用于临床诊断。

应用示例一（MGI 平台）

模拟模型

来源于 2 个健康捐献者的血浆游离 DNA 分别以 1% 和 0.3% 比例混合，用于模拟游离血浆 DNA 中低频突变位点的检测，文库制备总投入量分别为 10 ng 和 25 ng；针对已知 SNP 位点设计捕获 panel（图1）。通过 MGISEQ-2000 测序平台测序后，利用双端分子标签（Bi-molecular Identifer, BMI），在不同分析与过滤方法下进行低频突变分析（表1）。

图 1. 低频突变模拟模型。

表 1. 分析与过滤方法

分析模式	详情
No BMI	根据片段在基因组上比对的起始、终止位点去除重复。
SSCS	利用单链分子标签进行一致性分析（Call Molecular Consensus Reads），形成单链一致性序列（Single Strand Consensus Sequences, SSCS）。
DCS211	利用双链分子标签，即互补链（Top / Bottom）分子标签进行一致性分析，形成双链一致性序列（Duplex Consensus Sequences, DCS），且Top与Bottom Reads均 ≥ 1。
DCS633	利用双链分子标签，即互补链（Top / Bottom）分子标签进行一致性分析，形成 DCS，且 Top 与 Bottom Reads 均 ≥ 3。
DCS211 (≥ 2)	在 DCS211 的基础上，支持该突变的 DCS 一致性序列 ≥ 2。
DCS633 (≥ 2)	在 DCS633 的基础上，支持该突变的 DCS 一致性序列 ≥ 2。

灵敏度与阳性预测值

图 2. 不同分析模式对于 1% 和 0.5% 模拟突变位点的 A. 灵敏度与 B. 阳性预测值；不同分析模式对于 0.3% 和 0.15% 模拟突变位点的 C. 灵敏度与 D. 阳性预测值。

更多详情请参考 NadPrep^®️ 血浆游离 DNA 双端分子标签文库构建试剂盒（for MGI）相关产品表现。

标准品分析示例

表 2. NanOnCT Panel v1.0 结合双端分子标签对 ctDNA 标准品的分析

Variants	MGISEQ-2000
Variants	SSCS	DCS211
EGFR_L858R	0.75%	0.82%
EGFR_T790M	1.29%	1.38%
EGFR_delE746_A750	0.93%	1.04%
PIK3CA_E545K	0.92%	0.8%
KRAS_G12D	0.57%	0.71%
KRAS_A146T	1.01%	0.67%
NRAS_Q61K	1.31%	0.89%
EGFR_insV769_D770	1.37%	1.3%

注：标准品为肺癌 ctDNA 标准品套装，1% AF（菁良，GW-OCTM009），利用 NadPrep^®️系列双端分子标签文库构建试剂盒建库，NanOnCT Panel v1.0 对目标区域进行靶向富集，平均原始测序深度 ~ 30,000 x。

DCS211：Duplex consensus sequence，双链一致性序列；

SSCS：Single strand consensus sequence，单链一致性序列。

应用示例二（Illumina 平台）

模拟模型

来源于 2 个健康捐献者的血浆游离 DNA 以 1% 比例混合，用于模拟游离血浆 DNA 中低频突变位点的检测，文库制备总投入量为 10 ng；针对已知 SNP 位点设计捕获 panel（图3）。通过 Illumina HiSeq X, PE150 平台测序后，利用双端分子标签（UMI），在不同分析与过滤方法下进行低频突变分析（表3）。

图 3. 低频突变模拟模型。来源于2个健康捐献者的 cfDNA 以 1% 比例混合，文库制备总投入量为 10 ng。1% 及 0.5% 模拟突变位点数量统计如右表所示。

表 3. 分析与过滤方法

分析模式	详情
No UMI	根据片段在基因组上比对的起始、终止位点去除重复。
SSCS	利用单链分子标签进行一致性分析（Call Molecular Consensus Reads），形成单链一致性序列（Single Strand Consensus Sequences, SSCS）。
DCS211	利用双链分子标签，即互补链（Top / Bottom）分子标签进行一致性分析，形成双链一致性序列（Duplex Consensus Sequences, DCS），且Top与Bottom Reads均 ≥ 1。
DCS633	利用双链分子标签，即互补链（Top / Bottom）分子标签进行一致性分析，形成 DCS，且 Top 与 Bottom Reads 均 ≥ 3。
DCS211 (≥ 2)	在 DCS211 的基础上，支持该突变的 DCS 一致性序列 ≥ 2。
DCS633 (≥ 2)	在 DCS633 的基础上，支持该突变的 DCS 一致性序列 ≥ 2。