DNA 和 RNA 双捕获 | 共同探索临床突变证据
背景
目前 DNA 和 RNA 靶向捕获测序是现有临床基因诊断中的主流技术。其中，DNA 靶向捕获检测主要用于鉴定和评估基因变异带来的致病性影响，而 RNA 靶向捕获测序或者 RNAseq 多用于基因融合事件检测。由于真实世界中变异的罕见性和复杂性，不是所有的变异都能被单一方式所检测到，将 DNA 检测与 RNA 检测相结合，可更大程度的提高临床获益率。
多项临床研究表明 DNA 和 RNA 靶向捕获测序的联合分析可详解出包括单核苷酸变异 (SNV)、小插入或缺失 (Indel)、拷贝数变异 (CNV)、剪接变异 (SV)、基因融合 (GF)、肿瘤突变负荷 (TMB) 和微卫星不稳定性 (MSI) 在内的多个分子标志物层面构建的肿瘤分子亚型，结合详细的临床注释，其综合型图谱可用于评估不同基因变异的组合对临床诊疗结果的影响[1-2]。最新的非小细胞肺癌 NCCN 指南在分子检测方法中提出，对于在常见 DNA 的 NGS 检测中没有可识别的驱动癌基因的患者 (尤其不吸烟者)，推荐使用基于 RNA 的 NGS 检测去最大程度地检测融合事件[3-4]。
实验设计
样本来源
样本为匿名的 3 例结直肠癌和 1 例胃癌的 FFPE 配对样本，编号分别为 CC1、CC2、CC3 和 GC1，投入量均为 100 ng。
捕获测序
样本 RNA 经NadPrep® Total RNA-To-DNA Module 转化为 DNA，与样本 DNA 一同利用 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒分别构建预文库，再进行靶向捕获测序。捕获 Panel 为 NanOnco Plus Panel v2.0 (以下简称为 Onco V2) 与 HiSNP Panel v1.0 (以下简称为 HiSNP) 混合而成的泛实体瘤大 Panel。
Onco V2 靶向实体瘤研究中被广泛关注的 565 个基因 (含 HLA 基因) 的全部编码区域，一系列与常见融合相关的内含子区域，以及 14 个经典的微卫星序列，共涉及 578 个基因，覆盖基因组约 2.6 Mb 区域。
HiSNP 是一款基础 SNP 骨架 Panel，靶向 > 9,000 个高 MAF 值的 SNP 位点，以约 300 Kb 的间隔覆盖整个人基因组，可用于提供反映基因组组成状态的信息，也可用于 RNA 数据的质控，评估 DNA 污染程度。
相关试剂信息如表1. ：
表1. 建库和杂交捕获试剂信息表
分析方法
真实肿瘤样本的分子变异图谱的主要分析软件有 GATK、 STAR 和 Factera 等。其中， DNA 层面变异图谱分析包括数据质控和过滤、DNA 比对、SNP/Indel 检测 (胚系和体细胞变异)、CNV 检测和融合检测；RNA 层面变异图谱分析则包括数据质控和过滤、RNA 比对、表达定量 (RPKM)、SNP/Indel 检测和融合检测。
具体分析软件信息如表2. ：
表2. 分析软件列表
DNA 和 RNA 捕获测序表现
4 例肿瘤样本的 DNA 捕获测序的中靶率均在 86% 以上，均一性指标 0.2x mean depth coverage 均达到 99% 以上，不同 GC 含量区域的覆盖度基本一致 (如图1. )，符合分析标准。
图1. 真实肿瘤样本的DNA捕获测序表现
3 例结直肠癌肿瘤样本的 RNA 捕获中靶率为 72%~89%，相应的 rRNA 数据占比在 1%~12%，中靶数据里外显子部分占比 85%~94%。1 例胃癌肿瘤样本的 RNA 质量较低，肿瘤和对照的捕获中靶率分别为 65% 和 53%，rRNA 污染则达到 21% 和 37%，不过，中靶数据里外显子部分占比均在 90% 以上 (图2. A&B)。
利用捕获 Panel 中分布于基因组非外显子区且不表达的 9000 多个 SNP 位点，可以评估 RNA 受 gDNA 污染的程度：在 RNA 靶向捕获数据中，这些 SNP 位点捕获 Reads 均一化处理为 Reads Count (Reads per Gb data)，并与阈值 10 比较判断(详情请见：抓你，RNA)。结果显示，CC2-T 和 CC3-T 样本 RNA 捕获结果中的 Reads Count 均在 20 以上，表明这两个样本存在一定程度的 gDNA 污染 (图2. C)。
图2. 真实样本 RNA 靶向捕获结果
DNA 和 RNA 捕获的突变分析一致性
我们首先对比分析了 4 例肿瘤样本在 DNA 和 RNA 层面胚系突变情况，对比区域为共有的外显子区域。从韦恩图可以看出，两者突变重叠的占比从 50% 至 80% 不等，存在显著的差异 (图3. )，这主要跟 RNA 的测序深度较低和基因表达丰度不高有关。
图3. 真实样本 DNA 和 RNA 层面胚系突变差异分析
4 例肿瘤样本在 DNA 和 RNA 层面检出的临床致病相关体细胞突变如表 3 所示。CC2 和 CC3 肿瘤样本的临床致病突变在 DNA 和 RNA 捕获中均检出，且完全一致。而在 CC1 肿瘤样本中，DNA 捕获检测到的 AKT1 E17K 和 KRAS G12V 突变，却在 RNA 捕获中未能检出。
当我们进一步分析原始 BAM 文件时，发现其实这两个位点的突变在 DNA 和 RNA 捕获均有不少支持的 Reads，其在 DNA 捕获的突变频率分别达到了 43% 和 46%，在 RNA 捕获中则分别为 13% 和 37% (图4. )。IGV 的比对结果显示 RNA 捕获时致病突变位点的碱基深度分别只有 15x 和 81x，远低于 DNA 捕获时的平均 300x 深度。因此，CC1 肿瘤样本 RNA 捕获时的漏检原因为 GATK 分析流程对 RNA 过滤条件过于严格，并非是 Panel 对 RNA 突变的捕获遗漏所致。
表3. 真实样本临床致病变异情况
图4. CC1 样本的 IGV 截图
DNA CNV 和 RNA 表达相关分析
利用 Onco V2 中覆盖的基因外显子区域，进行的 exon-based CNV 变异分析 (DECoN) 显示，CC1、CC2 和 CC3 样本均发生了 CTNNB1 基因的拷贝数缺失现象 (图5. A)。在 IGV 中可直观的看到，这 3 个肿瘤样本的 CTNNB1 基因的第三号外显子区域深度明显降低，证明该基因确实发生缺失 (图5. B)。借助 Sanger 测序，我们进一步证实了这 3 个肿瘤样本中外显子缺失的具体位置，且各不相同 (图5. C)。有意思的是，这 3 个结直肠癌肿瘤样本的 CTNNB1 的 RNA 表达量也均略微高于对照样本 (图5. D)。
此前有报道证实，CTNNB1 的第 3 号外显子是结直肠癌的突变热点区域[5]。在转移性结直肠癌的病例中，也存在 CTNNB1 跨越第 3 号外显子区域的非移码缺失现象。本次研究中发现的 CTNNB1 基因的第 3 号外显子缺失，虽然对其 RNA 表达影响不大，但是其编码的蛋白功能必然受到了很大的影响。
向下滑动查看
图5. A 4 对 FFPE 样本靶标基因 SCNV 热图，靶标发生扩增或者缺失的比值 (Tumor/Normal 的拷贝数比值)
图5. B 3 对结直肠癌样本 CTNNB1 IGV 截图
图5. C 3 对结直肠癌样本 CTNNB1 Sanger 验证结果
图5. D 3 对结直肠癌样本 CTNNB1 的基因表达情况
本次真实 FFPE 样本 RNA 捕获全部 565 个靶标基因的表达量热图如图6. ，胃癌 GC 样本的表达谱跟结直肠癌的表达谱聚类区分度明显，说明组织特异性没有因为捕获而丢失。
图6. 真实 FFPE 样本 RNA 捕获全部 565 个靶标基因的表达量热图
另外，HiSNP 以 300 Kb 的间隔平均分布于人基因组的 non-exonic 区域，可检测全基因组范围内的大片段 CNV，CNVkit 分析的全局结果如图7. 所示，这 4 对样本也存在显著不同的 CNV 情形。
图7. 4 对 FFPE 样本全基因组 SCNV 分布
结束语
基于 gDNA 层面的靶向捕获测序能够精确定位基因组中 SNP、Indel 和 SV 断点，从而识别基因组变异。但 DNA 水平的改变不一定导致生物表型的改变，因此在转录组和蛋白质组水平的“多验”检查势在必行。据文献报道，约 12.8% 在 DNA 层面检测到的不常见融合没有产生异常转录或蛋白质，此类患者接受靶向治疗无效。对于融合基因检测，基于 NGS 技术的 DNA 和 RNA 同时检测显然是更优的策略 (详情请见：FFPE 样本的融合基因检测：DNA or RNA？& RNA融合基因分析示例)。除此以外，在 DNA 层面上的 SNP、Indel 和 CNV，是否影响 RNA 和蛋白依然是值得研究的课题。
纳昂达科技推出 NadPrep®总 RNA 反转录模块，搭配 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒，可进行 DNA 和 RNA 文库构建，结合下游杂交捕获试剂方案，可实现 DNA 和 RNA 联合靶向捕获检测和分析。NanOnco Plus Panel v2.0 作为一款优秀的泛癌 Panel，其产品设计之初就完整覆盖全部靶标基因的全部外显子区域，可用于 DNA 或 RNA 层面的靶向捕获测序 (详情请见：FFPE 样本 RNA 靶向捕获应用指南)。
本文中，我们结合 4 例真实 FFPE 临床样本的 DNA 和 RNA 层面的捕获测序分析显示：RNA 层面的 SNV 和 Indel 变异分析，与 DNA 层面突变的转录转递进行验证，二者结果基本是相吻合的。而 DNA 靶向捕获发现的 CTNNB1 外显子缺失，并未显著影响到其 RNA 表达量。
关于纳昂达科技
纳昂达科技秉承“ Nano Trans More ”的核心理念和“靶向精准，用心服务诊断”的奋斗宗旨，致力于为科研院校、医疗机构、临检单位、产业公司、测序服务商等提供专业化和高质量的靶向测序产品与闭环解决方案。
纳昂达科技已通过高新技术企业、江苏省科技型中小企业和南京市精准高通量测序工程技术研究中心认定，并拥有> 2,000 平米的高通量测序研发中心和> 4,000 平米的 GMP 级别(YY/T 0287-2017 idt ISO 13485:2016) 体外诊断试剂生产基地，建立了从市场调研、产品设计、生产制造到售后服务完整的质量管理体系。
纳昂达专注于精准靶向试剂和配套自动化仪器的开发、生产、销售和服务，目前拥有 MGI 和 Illumina 双测序平台多款 NadPrep®文库构建试剂盒和全套液相杂交相关产品。明星产品包括 NGS 全流程自动化工作站、肿瘤全外显子 Panel、泛实体瘤和血液肿瘤 Panel 以及呼吸道病毒 Panel 等，并提供全面完善的双平台捕获探针定制化服务。纳昂达科技的靶向捕获产品拥有与国际同行业媲美的高质量水准，获得了客户一致的信赖。
纳昂达的销售网络覆盖全国并已外延至海外地区。纳昂达将与客户共成长，对客户的需求全力以赴，为全球用户提供靶向测序解决方案和 IVD 试剂原料。
微信号｜nanodigmbiotech
扫码关注我们
参考文献
[1] Song Z, Xu C, He Y, et al. Simultaneous detection of gene fusions and base mutations in cancer tissue biopsies by sequencing dual nucleic acid templates in unified reaction[J]. Clinical Chemistry, 2020, 66(1): 178-187.
[2] Davies K D, Lomboy A, Lawrence C A, et al. DNA-based versus RNA-based detection of MET exon 14 skipping events in lung cancer[J]. Journal of Thoracic Oncology, 2019, 14(4): 737-741.
[3] Beaubier N, Bontrager M, Huether R, et al. Integrated genomic profiling expands clinical options for patients with cancer[J]. Nature biotechnology, 2019, 37(11): 1351-1360.
[4] Zhang Y, Zeng L, Zhou C, et al. Detection of nonreciprocal/reciprocal ALK translocation as poor predictive marker in patients with first-line crizotinib-treated ALK-rearranged NSCLC[J]. Journal of Thoracic Oncology, 2020, 15(6): 1027-1036.
[5] Kim S, Jeong S. Mutation hotspots in the β-catenin gene: lessons from the human cancer genome databases[J]. Molecules and Cells, 2019, 42(1): 8.
