纳昂达靶向捕获方案赋能 TAPS+ 甲基化与突变共检测
01 背景
1.1 传统甲基化-突变检测方案的瓶颈
目前，亚硫酸氢盐测序 (bisulfite sequencing, BS-seq) 仍是甲基化检测领域广泛应用的金标准技术。其基本原理是利用亚硫酸氢盐将未甲基化胞嘧啶 (C) 转化为尿嘧啶 (U) 再转化为胸腺嘧啶 (T)，而甲基化胞嘧啶则基本保持不变，从而实现 DNA 甲基化状态的检测。然而，大量 C>T 转换会显著降低文库的碱基复杂度，并使部分真实的 C>T/G>A 遗传变异与转化产生的碱基变化难以准确区分。因此，若想同时获得甲基化和基因突变信息，只能将样本一分为二：一份做甲基化测序、一份做常规突变测序，完成两套独立的建库、捕获、测序流程。
该模式带来诸多现实痛点：1) 珍贵 cfDNA、FFPE 等微量样本消耗翻倍；2) 多轮实验引入批次效应，干扰甲基化与突变信号的关联解读；3) 实验周期长，测序成本居高不下，限制了队列样本、低起始量临床样本的应用。因此，如何在有限样本中，通过单一检测流程同步获取甲基化与基因变异信息、提高检测效率和数据整合能力成为重要研究方向。
1.2 TAPS+ 带来甲基化与突变共检新选择
近年来，以 TAPS (TET 辅助吡啶硼烷测序)[1] 为代表的酶法正向甲基化转化技术的出现，为甲基化与突变共检开辟了新路径。TAPS 仅将甲基化修饰的 5mC 及 5hmC 转化为 T，而未甲基化的 C 不会发生转化，可最大限度保留原始的 ATCG 序列多样性，维持文库复杂度。这种正向读取 (Positive Readouts) 的转化方法无需破坏基因组原始序列，甲基化信号作为第五碱基被直接读取，有效保留了遗传变异信息 (如 SNV、InDel、CNV、SV)，成功规避了传统 BS-seq 法的核酸损伤、序列畸变、信息丢失等问题。
图片来源于 Watchmaker Genomics
1.3 纳昂达 × TAPS+: TAPS+ 靶向富集方案
现有公开的 TAPS+ 应用以全基因组测序 (WGS) 为主，但 WGS 存在测序成本较高、数据冗余较大等局限。对于聚焦特定甲基化标志物或基因变异的科研及临床检测，靶向捕获能够有效富集目标区域，提高测序数据利用效率。然而，目前适配 TAPS+ 转化后序列特征的标准化探针设计及靶向捕获配套体系仍相对有限。
纳昂达深耕靶向捕获领域多年，依托自主知识产权的纳昂达探针，以及成熟的文库构建与杂交捕获技术，推出适配 Watchmaker Genomics TAPS+ 酶法甲基化转化文库的靶向捕获整体解决方案。针对 TAPS+ 转化后的文库序列特征，采用双态法设计探针，并搭配纳昂达新推出的 μCaler® HyperMix Hybrid Capture Kit 实现 TAPS+ 转化文库的高效富集，进一步完善甲基化靶向检测技术路径。
TAPS+ 酶法转化与纳昂达靶向捕获方案联用，可充分发挥二者的技术优势：在同一个文库、单次杂交捕获反应中，同步精准解析样本甲基化修饰水平以及多种基因变异信息，一站式完成表观遗传修饰与分子变异联合分析，可为肿瘤标志物筛选、表观遗传机制研究及转化医学研究提供更精准、更高效、更可靠的技术支持。
02 方案设计
方案 1
TAPS+ 和 UMBS 两种甲基化转化方案的性能比较
▶ 样本来源：健康人源血浆 cfDNA。
▶ 文库制备：
1) TAPS+ 转化文库：利用 Watchmaker DNA Library Prep Kit with TAPS+ (由 Watchmaker Genomics 公司提供) 搭配 NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 构建甲基化文库；
2) UMBS (Ultra-Mild Bisulfite Sequencing, UMBS-seq) 转化文库：利用 NadPrep® Methyl Library Preparation Module v2 搭配 NadPrep® Methyl Stubby Adapter (UDI) Module v2 (for Illumina®) 和 UMBS 转化模块 [BNUFT® Ultrafast Bisulfite Kit (Bionova, BN4300-005)] 构建甲基化文库。
方案 2
TAPS+ 技术结合纳昂达杂交捕获体系性能验证
▶ 样本来源：泛肿瘤 800 gDNA 标准品以及不同甲基化水平的模拟样本 (0%, 50% 和 100%)；
▶ 文库制备：
利用 Watchmaker DNA Library Prep Kit with TAPS+ 搭配 NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 构建甲基化文库；
▶ 杂交捕获：
以 μCaler® HyperMix Hybrid Capture Kit (for Illumina®)、定制甲基化检测 Panel 和定制化突变检测 Panel 完成杂交捕获。
03 方案表现
3.1 还原真实甲基化状态
为评估 UMBS 与 TAPS+ 两种甲基化转化方案的性能差异，本实验采用健康人血浆 cfDNA，经核酸提取、文库构建后进行全基因组测序分析。以转录起始位点 (transcription start site, TSS) 为中心，选取上下游各 2 Kb 区间作为分析窗口，将测序深度 > 5x 设为 CpG 位点的覆盖过滤阈值，分析 TSS 上下游 (共 4 Kb) 区域内 CpG 位点的覆盖率与甲基化水平分布特征。
结果如图 1. A-B 所示，在 TSS 上下游区域内，TAPS+ 方案的 CpG 位点覆盖率整体高于 UMBS 方案。此外，在相同测序深度过滤条件 (> 5x CpG) 下，两种转化方案检测得到的甲基化水平均在 TSS 邻近的启动子区域呈现典型 "V 型" 低谷；但 TAPS+ 方案的甲基化水平整体更低，更符合启动子 CpG 岛天然的低甲基化特征[2, 3]。上述结果表明，在本次实验设置的同等测序深度条件下，TAPS+ 转化方案取得了更理想的 CpG 位点有效覆盖和甲基化位点信息。
图 1. TAPS+ 和 UMBS 转化方案对 cfDNA 样本的 TSS 上下游区域 CpG 位点的检测表现。A. 区域内 CpG 位点的覆盖度；B. 区域内 CpG 位点的甲基化水平。
注：对甲基化文库进行全基因组测序，测序模式为 NovaSeq 6000，PE150，测序数据量为 100 Gb。
3.2 高效、稳定的甲基化转化能力
为充分评价 TAPS+ 方案的甲基化转化能力，我们利用 50 ng 不同甲基化水平 (0%, 50% 和 100%) 的模拟样本构建甲基化文库，并以 μCaler® HyperMix Hybrid Capture Kit (for Illumina®) 和定制甲基化检测 Panel 完成杂交捕获。如图 2 所示，TAPS+ 方案在不同甲基化水平的样本中转化效率均超过 96%，展现出稳定且高效的转化效率，高度符合理论预期。结果表明，此方案在宽范围甲基化水平条件下均可维持稳定可靠的转化性能，证实其在甲基化分析中具备良好的稳健性与适用性。
图 2. 组合方案对不同甲基化水平样本的转化效率稳定。以 Methylated pUC19 DNA 为内参评估 TAPS+ 转化效率。测序模式为 NovaSeq 6000，PE150。随机选取 0.3 Gb 用于数据分析。
注：模拟样本为人甲基化阳性对照 100% Methylated DNA (zymo, D5014-2) 和阴性对照 0% Methylated DNA (zymo, D5014-1) 经不同比例混合以模拟不同甲基化水平 (0%，50% 和 100%)。
3.3 纳昂达靶向捕获方案 × TAPS+：捕获高质量甲基化文库
本研究利用 μCaler® HyperMix Hybrid Capture Kit (for Illumina®) 搭配定制甲基化检测 Panel，对经 TAPS+ 转化的不同甲基化水平文库实现了高效富集。如图 3 所示，在甲基化水平分别为 0%, 50% 和 100% 的文库中，比对率均稳定保持在 99% 以上，中靶率均达到 85% 以上。实验结果显示，纳昂达杂交捕获系统及其配套探针与 TAPS+ 转化文库之间具有良好适配性。针对不同甲基化水平的文库样本，该组合方案均能保持稳定、高效的目标区域捕获性能，可为肿瘤早筛、液体活检等临床研究场景中的甲基化检测提供可靠的技术选择。
图 3. 组合方案对不同甲基化水平样本的捕获表现。
3.4 纳昂达靶向捕获方案 × TAPS+：精准识别多种变异类型
TAPS+ 的正向读取转化方法能够实现 "一份文库，同步获取甲基化和突变信息"，结合灵敏、特异的纳昂达靶向捕获体系可实现 SNP、融合、缺失等多种突变类型的精准识别。如图 4 所示，纳昂达靶向捕获方案联合 TAPS+ 技术准确检测出了标准品中的多个变异位点，涵盖不同变异类型，且突变频率接近理论值，展现其优越的变异检测能力、充分证明了该组合方案能够为甲基化与基因变异的同步检测提供可靠技术支撑。
图 4. 组合方案对捕获数据中变异频率与标准品标称频率的一致性展示。
注：起始样本为 50 ng 泛肿瘤 800 gDNA 标准品 (菁良，GW-OGTM800)。
04 结语
依托多年靶向杂交捕获技术积累，纳昂达将自主知识产权的探针设计算法和成熟的杂交捕获体系与前沿的 TAPS+ 技术深度融合。实验结果表明，TAPS+ 稳定的甲基化转化性能结合纳昂达杂交捕获体系，可对不同甲基化水平的模拟样本进行准确定量，并有效识别标准品中的多类型基因变异，实现同一份文库中甲基化状态与基因变异信息的同步解析，为甲基化与基因变异联合检测提供了新的技术路径。
此次 TAPS+ 技术与纳昂达靶向捕获方案的强强联合，不仅验证了两种技术体系的良好兼容性，也进一步体现了纳昂达将前沿甲基化技术与成熟产品体系快速融合、协同优化并落地应用的综合技术能力，为甲基化检测方案的持续创新与应用拓展提供了有力支撑。
【关于 Watchmaker Genomics】
Watchmaker Genomics (沃奇酶科) 是一家生命科学公司，致力于开创高性能酶工程以推动基因组学、分子诊断和合成生物学领域的突破。利用先进的定向进化和精准蛋白质设计技术，Watchmaker 开发出各种酶学性能首屈一指的分子酶，可提高新一代测序 (NGS) 和分子检测 (MDx) 工作流程的准确性、灵敏度和效率。Watchmaker总部位于科罗拉多州博尔德市，公司致力于与全球顶尖研究人员、诊断开发商和生物技术公司合作，共同拓展分子生物学的边界。
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[1]. Liu Y, Siejka-Zielińska P, Velikova G, et al. Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution[J]. Nature biotechnology, 2019, 37(4): 424-429.
[2]. Jin Y, Conneely K N, Ma W, et al. Whole-genome bisulfite sequencing of cell-free DNA unveils age-dependent and ALS-associated methylation alterations[J]. Cell & Bioscience, 2025, 15(1): 26.
[3]. Lister R, Pelizzola M, Dowen R H, et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences[J]. Nature, 2009, 462(7271): 315-322.
