新品上线 | 基于 μCaler 杂交捕获的 AML MRD 整体解决方案 (下)

01 背景

   流式细胞术 (MFC) 是 AML MRD 检测专家共识中的推荐方法之一，需要从至少 3 mL 骨髓液中获取 50~100 万个有核细胞，以实现 0.1% 的检测敏感性[1,2]。NGS法可同时检测多种突变位点，并能实现低至 0.0001% 的检测敏感性。但在临床实践中，检测敏感性既与样本、具体检测方法密切相关，也要权衡成本。在上篇中，我们展示了纳昂达基于 μCaler^® 杂交捕获系统的 AML MRD 整体解决方案的技术优势。在下篇中，我们重点分享具体数据表现。

02 μCaler^® AML MRD 全流程解决方案

  该方案基于杂交捕获测序设计，可用于成人急性髓系白血病 MRD 检测和研究。该方案精选的 MRD 靶标覆盖约 90% AML患者的突变，可评估包含碱基替换、插入/缺失、基因融合在内的多种变异信息。结合纳昂达专利的 μCaler^® 杂交捕获技术和双端分子标签，可实现超高检测灵敏度，且能够在单日内完成全部实验流程。

图1. μCaler^® AML MRD 全流程

03 方案表现

低频突变检出

理论计算可知，若以 95% 置信区间下检测指定突变位点至少 1 个支持读长为标准，NGS 法实现 0.05% 敏感性应达到 >6000x 有效测序深度；实现 0.025% 敏感性应达到 >12000x  有效测序深度。分子标签可有效排除 PCR 扩增错误、测序错误等对低频突变检测的干扰，但需要极高的测序量进行生信分析。在 μCaler^® AML MRD 方案中，片段化后 DNA 投入量、有效测序深度和预期敏感性的关系如表1. 所示。

表1. 片段化 DNA 投入量与预期敏感性的关系

注：

1, 用于预文库构建的片段化 DNA 投入量；

2, DCS211: 双链一致性序列分析方法(Duplex Consensus Sequences)；

3, 95% 置信区间内检测的理论突变频率下限：1 个已知突变位点，在 95% 的置信区间内能够检测到该突变信息的最低理论突变频率; 3 个已知突变位点，在 95% 的置信区间内能够检测到任意一个突变信息的最低理论突变频率。

我们基于商用标准品 (Genewell, GW-OGTM800 & Promega, G1471) 构建了一个含有突变频率在 0.025% ~ 0.1% 的模拟样本，并取片段化后 300 ng DNA 进行预文库构建和捕获测序。测试结果显示，整体捕获中靶率约为 70% 且稳定，覆盖均一性良好 (图2. A&B)。经过分子标签过滤后，每个文库的平均有效测序深度可达到 18000x (DCS211 分析，图2. C)。

图2. μCaler® AML MRD 方案的捕获测序表现。A. 中靶率等基本质控信息度；B. 覆盖均一性；C. 测序深度。预文库构建、捕获测序和分子标签分析均参照 μCaler® AML MRD 全流程解决方案使用说明书进行。测序模式：Illumina Novaseq 6000，PE150，每个样本 45 Gb。

样本中 5 个突变位点的有效测序深度均达到 20000x 以上，且均有多个读长支持 (图3. A&B)。从突变频率来看，检测值也基本与预测值相符合 (图3. C)。值得注意的是，在分子标签 SSCS 分析模式下，有效测序深度平均可提升至 35000x 以上，也均能有效检测出全部突变位点，但此时阳性预测值 (PPV) 仅为 ~20%，表明存在大量的假阳性检测结果 (图2.C & 图4.)。在分子标签 DCS211 分析模式下，突变位点检出的同时，PPV 则一直保持在 ~100% (图 4.)。

图3. 5 个突变位点的检出情况。A. 平均深度 (DCS211 ≥ 1)；B. 支持突变的有效 reads 数；C. 理论与检出的突变频率。

图4. 不同分子标签分析模式下的敏感性和阳性预测值。A. 敏感性；B. 阳性预测值。

AML中的特殊突变

约 1/3 的 AML 患者存在 FMS 样酪氨酸激酶 3 (FLT3) 受体的激活突变，其近膜结构域有 3～400 bp 不等的核苷酸内串联重复 (ITD) 序列。FLT3-ITD 的突变具有患者特异性，每个患者突变类型均具有独特长度，并且突变与不良的预后相关[3]。NGS 法能够检测 FLT3-ITD 的突变位置、碱基序列、插入长度和突变频率等信息，有效地解决传统 PCR 和毛细管电泳法的不足。

血液肿瘤 gDNA 质控品 (LDT-831) 除囊括常见突变位点外，也设计有 21 个碱基插入的 FLT3-ITD 突变。具体突变信息和 μCaler® AML MRD 方案的捕获结果如表2. 所示，突变检测频率与预测值基本一致。FLT3-ITD 突变频率检测值略低，但同样可以有效捕获 (图5.)。

表2. 血液肿瘤g DNA 质控品 (LDT-831) 的突变检测一致性

图5. FLT3-ITD 的检测示意图