LDT Bioscience公司MRD ctDNA 质控品在纳昂达泛癌Panel高深度测序下的极致性能评估
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背景
微小残留病灶（MRD）是肿瘤治疗后体内残留的微量肿瘤细胞的状态,也是肿瘤复发的主要原因。在技术方案相对成熟的血液肿瘤中，通过 TCR/BCR 测序分析能够对肿瘤亚克隆或演化克隆导致的复发风险进行有效评估，是血液肿瘤复发和移植治疗失败的关键原因。然而相比血液肿瘤，实体瘤的 MRD 检测会更难，所要求的检测灵敏度更高，主要原因是实体瘤释放的肿瘤 ctDNA 会受自身以及正常细胞代谢、坏死、凋亡等诸多因素干扰，且在不同类型实体瘤中，肿瘤ctDNA 的释放会存在很大的差异。
因此，充分检出血液中微弱的肿瘤细胞中的 ctDNA 信号是准确评估实体瘤复发的重要前提条件。2021年3月《肺癌 MRD 的检测和临床应用共识》指出基于 NGS 技术的 MRD 检测，其基本技术标准需稳定检出丰度 ≥0.02% 的 ctDNA。2022年《ctDNA 高通量测序临床实践专家共识》则系统性的对 ctDNA NGS 检测技术在肿瘤伴随诊断、获得性耐药机制分析、治疗疗效评估及预后风险分层中的价值进行了系统性的总结，同时也强调了 ctDNA NGS 检测中试剂性能验证或性能确认的重要性。
基于这样的前提条件，纳昂达与国内首创 MRD 质控品公司 LDT Bioscicence 合作，利用高深度 ctDNA NGS 测序对 MRD 检测中的性能评估进行了相关测试，以期为国内 MRD 检测技术的快速应用寻找合适的性能评估标准。
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实验方案
首先，使用纳昂达 NanOnco Plus Panel v3.0 泛癌 Panel 以及配套 NGS 靶向捕获整体解决方案分别对 LDT Bioscience 公司 100%，0.5%，0.05%，0.005% 肿瘤丰度的 ctDNA 质控品以及对应胚系阴性对照进行高质量捕获文库（含分子标签）构建，并分别采用 Illumina NovaSeq 测序平台进行了 ≥ 80G 高深度测序，测序有效深度 ≥ 20000X。
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质控品介绍
LDT Bioscience 泛肿瘤 MRD ctDNA 质控品 （LDT-999）包含 3 个不同肿瘤丰度的阳性质控品和 1 个阴性对照，覆盖多个癌种里共计超过 1000 个肿瘤突变位点，突变频率在 0.005%-0.5% 之间。设计目的是用于临床前性能研究、药物临床试验伴随诊断及患者入排、探索性临床研究等基于 ctDNA 动态监测方法学的质量标准体系建立。
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捕获 Panel 介绍
NanOnco Plus Panel v3.0 是一款基于 2020 年纳昂达科技自主研发的 NanOnco Plus Panel v2.0 的升级版产品。该款 Panel 覆盖 620 个与肿瘤靶向治疗、免疫治疗、预后以及化疗相关基因，覆盖约 2.4 Mb 基因组区域。在 v2.0 的基础上，v3.0 的全编码覆盖基因额外增加了 55 个，其中包括与 DNA 损伤修复、同源重组修复、免疫治疗及预后相关的基因，同时也增加了 62 个与靶向药物和化疗敏感性相关的多态性位点（证据等级 ≥ 2B）。
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实验结果
结合 LDT Bioscience 自主开发的 TAF 算法（TAF，即 Total Allelic Frequency），即对样本中所有规定范围内突变位点的支持 reads 集合进行归一化，从而计算出相应 TAF 值。以肿瘤细胞占比 100% 样本的测序突变总 reads 数（归一化）计为 TAF = 100%。其他样本的 TAF 值 = 样本的突变 reads 数（归一化）/肿瘤细胞占比 100% 样本的测序突变 reads 数（归一化）* 100%。具体结果如下表：
表1. 泛肿瘤 MRD ctDNA 质控品中不同样本的 TAF 值
通过归一化的 TAF 值与肿瘤丰度的线性比较，我们可以发现，TAF 值随着肿瘤丰度的变化而变化，二者呈现良好的线性关系（R2 = 0.9995） （图1. ），TAF 值能够很好的反应该产品中的突变位点的总集，可用于 ctDNA-MRD 的检测性能评估。
图1. TAF 值与肿瘤丰度的关系
注：定义 X 值的含义为肿瘤丰度，Y值为 TAF，通过 B、C 和 D 这 3 组包含 TAF 值与肿瘤丰度的数据对他们进行线性方程拟合。
同时，为了进一步验证 MRD ctDNA 质控品在低频突变检测中的准确性，采用了 LDT Bioscience 自主开发的超低频数字- PCR 绝对定量技术（UIFDD-QC）对混合制备的肿瘤样本进行绝对定量。我们选取了其中 2 个具有代表性的肿瘤特征性基因突变位点，这 2 个位点在 MRD ctDNA 质控品肿瘤细胞中均为纯合突变，在配对的胚系阴性质控品中的等位基因突变频率为 0%。
表2. 泛肿瘤 MRD-ctDNA 产品的 DDPCR 标定结果
（因专利尚未公开，质控 Marker 详细信息后续可披露）
我们发现这两个肿瘤特征性突变位点在 0.5% 肿瘤突变丰度和 0.05% 肿瘤突变丰度质控品的 NGS 结果中均能有效检出。考虑到整体测序成本以及相关指南临床应用检测要求（≥0.02%），我们并没有进行更高深度的 NGS 测序。但是通过微滴式数字 PCR 绝对定量技术验证，我们发现这两个位点在 0.5% 和 0.05% 肿瘤突变丰度的质控制品中的结果与 NGS 分析结果几乎完全一致（因保密协议，纳昂达未索要详细的位点数据，此结果仅为 LDT bioscience 公司分析后的结论）。同时仅 ddPCR 验证 0.005% 肿瘤突变丰度的质控品中的结果也与实际倍比稀释后的理论丰度呈现很高的一致性（C 样本进行 10 倍稀释，理论 D 样本丰度为 0.005%，而数字 PCR 的结果为 0.006% 和 0.0057%）。
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总结
近几年，在术后复发、耐药监测、化疗敏感性分析等[1-3] 相关临床试验结果中证实了血液 MRD 监测的重要意义。特别在今年 7 月，欧洲医学肿瘤学会（ESMO）精准医学工作组关于癌症患者使用 ctDNA 检测给出了新的建议，文中肯定了 MRD 阳性在临床检测中意义，能够指导后续治疗，但同时也提出了目前可用的ctDNA MRD检测技术存在灵敏度以及假阴性的问题，因此在实际应用中对于 MRD 阴性的检测结果需要[4] 慎重处理。
造成灵敏度不够以及假阴性的原因有很多，但是仅技术本身而言，血液中 ctDNA 片段化严重，占比低等问题。整个建库体系中的连接效率、扩增效率、目标区域捕获效率等因素都会造成整体灵敏度低和假阳性的问题。因此，在 MRD 检测产品开发初期就需要格外注意上游原材料的整体性能表现。其次，建立良好的企业参考盘，包括阴阳性质控品则是判定检测结果可信度的重要衡量标准。
本次我们展示的 LDT Bioscience 公司泛肿瘤 MRD ctDNA 质控品在纳昂达 NanOnco Plus Panel v3.0 的捕获数据显示，这款标准品可用于突变频率在 0.005%-0.5% 的 MRD 性能验证。后续，我们将会同步更新更详细的质控 Marker 信息。
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纳昂达专注于精准靶向试剂和配套自动化仪器的开发、生产、销售和服务，目前拥有 MGI 和 Illumina 双测序平台多款 NadPrepⓇ 文库构建试剂盒和全套液相杂交相关产品。明星产品包括 NGS 全流程自动化工作站、肿瘤全外显子 Panel、泛实体瘤和血液肿瘤Panel以及呼吸道病毒 Panel 等，并提供全面完善的双平台捕获探针定制化服务。纳昂达科技的靶向捕获产品拥有与国际同行业媲美的高质量水准，获得了客户一致的信赖。
纳昂达的销售网络覆盖全国并已外延至海外地区。纳昂达将与客户共成长，对客户的需求全力以赴，为全球用户提供靶向测序解决方案和 IVD 试剂原料。
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LDT Bioscience依托自主建立的生物样本库、配套的生物信息数据库，高效助力分子诊断创新技术开发。公司自主研发、生产一系列分子诊断原料，包括参考品、质控品、模拟临床样本基质（肺泡灌洗液，脑脊液，血浆等）等，产品形式覆盖gDNA、RNA、 cfDNA、模拟血浆、模拟组织蜡块等多种产品线。
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参考文献
[1] Powles T, Assaf Z J, Davarpanah N, et al. ctDNA guiding adjuvant immunotherapy in urothelial carcinoma[J]. Nature, 2021, 595(7867): 432-437.
[2] Xia L, Mei J, Kang R, et al. Perioperative ctDNA-based molecular residual disease detection for non–small cell lung cancer: a prospective multicenter cohort study (LUNGCA-1)[J]. Clinical Cancer Research, 2021: OF1-OF10.
[3] Parikh A R, Van Seventer E E, Siravegna G, et al. Minimal Residual Disease Detection using a Plasma-only Circulating Tumor DNA Assay in Patients with Colorectal CancerPlasma-only ctDNA-guided MRD Detection in Patients with CRC[J]. Clinical Cancer Research, 2021, 27(20): 5586-5594.
[4] Pascual J, Attard G, Bidard F C, et al. ESMO recommendations on the use of circulating tumour DNA assays for patients with cancer: A report from the ESMO Precision Medicine Working Group[J]. Annals of Oncology, 2022, 33(8): 750-768.
