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可能原因 |
解决方案 |
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转化后文库被未转化文库污染 |
使用带滤芯 Tips；转化结束后及时更换新的乳胶手套， 更换新的工作台面以及新的移液器。 |
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重亚硫酸盐转化模块有效期较 短，过期后严重影响试剂盒性 能。重亚硫酸盐容易发生氧化， 结晶析出，导致重亚硫酸盐溶 液浓度降低，影响转化效率 |
在有效期以内使用转化试剂盒；减少重亚硫酸盐溶液暴 露在空气中的时间。 |
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投入量过高 |
使用酶转化方案时，严格控制样本投入量，推荐投入量 在 10-200 ng 之间。 |
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可能原因 |
解决方案 |
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原始样本定量存在误差 |
推荐使用 Qubit 的方法对打断后的 DNA 样本进行定量。 |
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低投入量样本使用重亚硫酸盐转化方案时，单链 DNA 回收效率较低。PCR 扩增循环数差3 个左右 |
增加扩增循环数，低投入量样本选择酶转化方案。 |
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可能原因 |
解决方案 |
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DNA 溶液中 EDTA 浓度 > 1 mM |
推荐使用磁珠法或柱式法纯化核酸，并用试剂盒提供的 TE Solution 溶解。 |
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DNA 纯度较差 |
样本纯度要求 OD260 / OD280 =1.8-2.0；OD260 / OD230 =2.0-2.5。 若样本中存在胍盐及杂蛋白污染时会影响酶切效率，推荐使用磁珠法或柱式法纯化核酸，并用试剂盒提供的 TE Solution 溶解。 |
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反应体系混匀不充分 |
确保片段化 Master Mix 充分混匀后，再加入样品中，并再次充分混匀后进行反应。 |
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连接步骤操作不合理导致片段自连 |
严格按照说明书推荐流程操作。 |
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可能原因 |
解决方案 |
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样本严重降解 |
降解较为严重的样本，如 FFPE C 级样本，同等片段化时间下，DNA 分布可能为 150-200 bp。 |
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片段化时间过长 |
应避免同时手动操作过多样本，可能因操作时间延长而导致片段化反应时间被动延长。 |
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室温操作时间较长 |
确保片段化体系各组分在转移至 PCR 仪之前，始终置于冰上。 |
可能原因为接头未稀释，推荐解决方案：
对于低起始量的样本建库，应严格定量并按照说明书推荐进行接头稀释。
NadPrep® 血浆游离 DNA 双端分子标签文库构建试剂盒对 cfDNA 样本的定量及片段质检，建议如下：
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类别 |
要求 |
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|---|---|---|---|
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提取试剂盒推荐 |
cfDNA |
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen；货号：55114） |
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溶剂 |
推荐使用无核酸酶水、0.1 × TE（low TE）、10 mM Tris-HCl（pH 8.0~8.5）或提取试剂盒配备的Buffer溶解DNA样品。酶切片段化试剂多对EDTA浓度敏感，应避免使用含EDTA的溶剂溶解。如有必要可进行1.8-2.0 ×磁珠纯化去除。 |
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定量 |
基于分光光度计原理的NanoDrop和基于双链DNA荧光染料的Qubit®、PicoGreen®进行定量。 |
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纯度 |
OD260/OD280=1.8-2.0；OD260/OD230=2.0-2.5。OD260/OD280>1.9表明有 RNA 污染，<1.6表明有蛋白质、酚等污染；OD260/OD230<2.0，则表明有碳水化合物、盐类或者有机溶剂污染。 |
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片段分布 |
cfDNA |
Bioanalyzer或Bioptic（Qsep）分析主峰~160 bp，次峰~320 bp。 |
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NadPrep®DNA 通用型文库构建试剂盒兼容多种类型样本的文库构建，包括全血 gDNA、FFPE、血浆 cfDNA 等。对于复杂样本的处理（如 FFPE 组织样本），推荐从源质控。样本应选取合适的提取试剂盒，并进行相应的定量及片段质检，建议如下：
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类别 |
要求 |
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|---|---|---|
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提取试剂盒 推荐 |
常规 gDNA |
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（天根；货号：DP304） |
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cfDNA |
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen；货号：55114） |
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FFPE 组织 gDNA |
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen；货号：56404） |
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溶剂 |
推荐使用无核酸酶水、0.1 × TE（low TE）、10 mM Tris-HCl（pH 8.0~8.5）或提取试剂盒配备的 Buffer溶解 DNA 样品。酶切片段化试剂多对 EDTA 浓度敏感，应避免使用含 EDTA 的溶剂溶解。如有必要可进行1.8-2.0 ×磁珠纯化去除。 |
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定量 |
基于分光光度计原理的 NanoDrop 和基于双链 DNA 荧光染料的Qubit®、PicoGreen®进行定量。 |
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纯度 |
OD260/OD280=1.8~2.0；OD260/OD230=2.0~2.5。OD260/OD280>1.9表明有RNA污染，<1.6表明有蛋白质、酚等污染；OD260/OD230<2.0，则表明有碳水化合物、盐类或者有机溶剂污染。 |
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片段分布 |
常规 gDNA |
1% 的琼脂糖凝胶电泳时，>15 kb 的清晰主带。 |
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cfDNA |
Bioanalyzer或 Bioptic（Qsep）分析主峰~160 bp，次峰~320 bp。 |
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FFPE 组织 gDNA |
1% 的琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪，如 Agilent 2100 进行样本完整性评估。 |
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纳昂达针对 Illumina® 平台目前有以下接头类型可供选择，用以与 NadPrep® DNA建库模块搭配，形成完整的 DNA 文库构建体系。
| 接头类型 | 说明 | 推荐应用 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| NadPrep® UDI Adapter | 双端唯一 8nt index 全长接头 | 全基因组，宏基因组，液相杂交靶向捕获测序 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| NadPrep® Universal Stubby Adapter | 双端唯一 10 nt index，当文库在 Illumina 平台测序时，支持双端 8 nt 或 10 nt 的标签读取模式，1-384 种 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NadPrep® UMI Adapter | 含随机分子标签通用短接头，可搭配双端唯一 10 nt index 引物，构建全长文库，1-48 种 | 低频突变检测（～1% 或以下突变频率） | |||||||||||||||||||||||||||||||||
接头比例过高会导致接头或接头二聚体残留；接头比例若不足则会影响连接效率进而降低文库产量。接头使用还应注意保存方式、稀释方法和稀释浓度：
• 保存：避免反复冻融，如欲多次使用，应提前分装；
• 稀释液：推荐使用试剂盒内TE Solution进行接头的稀释，但稀释液不建议长期保存；
• 稀释用量：根据样本起始投入量、片段大小，计算合适的接头与DNA片段摩尔比，可达最佳产量。具体推荐摩尔比，可参考相关说明书。
• 实验操作：保持连接反应在冰上进行，接头与连接体系分别加入，避免提前自连。
