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用户测评 | 纳昂达基于 DNBSEQ 平台的探针捕获 HLA 分型全流程解决方案

浏览量：155 / 发布时间：2024-12-24
HLA 编码基因是人类基因组上多态性最高的编码区域之一。HLA 抗原多态性与多种疾病相关，也与疫苗和药物靶向人群筛选、组织和器官移植等相关。例如，HLA 配型相合程度是器官、骨髓和干细胞移植成功的关键因素；肿瘤患者的 HLA 基因型以及肿瘤中的体系突变均有可能影响免疫治疗的疗效。因此，HLA 分型检测在移植医学、免疫类相关疾病研究、药物反应、血小板输注等领域具有重要意义。目前主要的分型方法包括 SBT (Sequencing based typing)、SSP (sequence-specific primer)、SSO (sequence-specific oligonucleotide) 以及高通量测序等。
纳昂达基于探针液相杂交捕获的 HLA 分型全流程解决方案完美适配华大智造 DNBSEQ 测序平台 (DNBSEQ-E25、DNBSEQ-G99 和 MGISEQ-2000)。得益于纳昂达极致简单的杂交过程和 DNBSEQ 平台高准确度和灵敏度、超低重复率、低标签跳跃率等优势，分型速度得以大幅提升，分型结果精准可靠。

01 产品方案


纳昂达 HLA 分型全流程解决方案参考 IPD-IMGT/HLA 数据库设计，靶向 11 个 HLA 基因 (I 类：HLA-A、B、C；II 类：HLA-DPA1、DPB1、DQA1、DAQB1、DRB1/3/4/5)，通过多态性探针组合，覆盖全部等位基因的全长基因组序列，可支持第四数段高精度分型。
该方案支持 384 种 MGI 平台的双端唯一标签接头 (NadPrep® Universal Adapter (MDI) Module) 进行文库构建，并可扩展至 768 种，无惧多样本考验。我们创新研发的通用接头 NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 更是拥有多达 768 种双端唯一标签，无需转化，一套文库即可双平台上机，让实验更加轻松自如！
 Figure 1
图 1. 纳昂达 HLA 分型全流程解决方案


02 测试方案


本次测试使用 UCLA HLA 参考品，搭配纳昂达 NadPrep® EZ DNA Library Preparation Module v2 建库模块和 NadPrep® Universal Adapter (MDI) Module 接头模块进行预文库构建，之后使用 HLAtyping Panel v2.0 和 NadPrep® ES Hybrid Capture Reagents 进行杂交捕获。捕获文库分别在 MGISEQ-2000、DNBSEQ-G99 和 DNBSEQ-E25 三款测序平台上进行测序。测序模式均为 PE150，数据量为 0.5 Gb/ 样本。


03 测试结果


结果显示，三个测序平台数据质量表现优异，GC 分布均衡。测序质量完全满足分析需要。
 
 Figure 2
图 2. 纳昂达 HLA 分型全流程解决方案搭配 MGI 测序平台的测序质量表现。A. 碱基质量值；B. 碱基分布


3 组测试数据分析结果均显示捕获性能优异，比对率均在 99% 以上，中靶率均在 80%以上。传统上用于评估捕获性能的均一性指标不适用于 HLA 分型的检测场景，原因是 HLA 基因部分区域具有较高的同源性，在 QC 分析的过程中，这部分区域可能导致均一性指标异常。不建议在基于测序的 HLA 分型中关注此部分的指标表现。

Figure 3 
图 3. 纳昂达 HLA 分型全流程解决方案搭配 MGI 测序平台的捕获性能表现


下机数据使用纳昂达 XCapViz 在线生信分析平台进行分析，得到第四数段的高精度分型结果，所有测试结果均与参考品的参考结果完全一致 (表 1.，表 2.)：


表 1. Class I 参考品分型结果

 Table 1
表 2. Class II 参考品分型结果
 Table 2
†：参考分型结果来源于 UCLA Pathology & Laboratory Medicine；
††：第四数段分型结果经过人工核对校正；
†††：根据 DOI: 10.1016/j.humimm.2020.07.001，DPB1*03:01:01G 和 DPB1*104:01 等同。


04 第四数段分型校正


HLA 基因本身具有极高的多态性，其第四数段尤为如此。不同个体间在这一区域的核苷酸序列存在大量差异，众多的等位基因变异使得准确区分和确定具体的分型变得极具挑战性。HLA 内含子区域中常常包含重复序列以及与其他区域相似的序列片段。这些重复和相似序列容易导致在捕获、比对等分析过程中出现混淆。在进行序列比对时，重复序列可能会使比对算法错误地将其与其他相似但并非真正匹配的区域对齐，从而影响对正确等位基因的判断，增加分型错误的风险。

在本次测试中，我们发现部分参考品在不同平台的自动初报分型结果在部分基因的第四数段有所波动。为了探究导致这一现象的原因，我们进行了深入分析。

在 C2-218 参考品中，DPA*01:03:01 初报结果第四数段分别报出了 04 和 31 两种分型。我们对下机 Reads 进行过滤后分别比对到 DPA*01:03:01:04 和 DPA*01:03:01:31 的参考序列，在不允许错配的情况下，发现三款测序平台的数据对于 DPA*01:03:01:04 的参考序列连续覆盖，而对 DPA*01:03:01:31 的参考序列覆盖不连续。经过对差异区域的进一步分析，我们发现在此处存在重复序列，影响比对结果。综合自动化初报结果和人工判读， C2-218 参考品真实分型应该为 DPA*01:03:01:04。
Figure 4 
图 4. C2-218 DPA*101:03:01 第四数段分型人工校正


按照同样的思路，我们对初报结果中其他第四数段有波动的基因一一进行了核实。造成这些波动的原因与上述例子相仿。对于提供了 DRB4 基因第四数段分型结果的 C2-211 参考品，三款测序平台的分型结果与参考结果完全一致。这表明第四数段的分型难度与对应基因和分型序列本身的特征密切相关。


05 纳昂达 HLA 分型解决方案


产品特色


5.1 第四数段精准分型


纳昂达 HLAtyping Panel v2.0 中，探针覆盖全部等位基因的全长基因组序列 (UTR、Exon、Intron)，纳入考虑全部型别，支持第四数段高精度分型。
Figure 5 
图 5. 纳昂达 HLA 分型全流程解决方案对靶标基因全长覆盖


5.2 多态性探针设计，超强容错


相比较于多重扩增子使用的引物，液相杂交捕获的探针具有更高的容错能力。纳昂达根据 IPD-IMGT/HLA 数据库，在探针的高度容错基础上又设计了大量多态探针，使得覆盖范围涵盖数据库中所有已知的参考序列。
Figure 6 
图 6. 多态探针有效捕获数据库中所有参考序列
Figure 7 
图 7. 相比常规探针设计，多态探针可获得更多等位基因型信息


5.3 半小时快速杂交，极简杂交体系


为了最大程度上缩短 TAT，提高操作的便捷度，纳昂达 HLA 分型解决方法特别搭配了全新优化的快速杂交捕获试剂 NadPrep® ES Hybrid Capture Reagents。杂交时间从 16 小时缩短到 0.5 小时，5 种 Wash Buffer 也精简到 1 种，可在单日内完成从样本到上机的全流程湿实验操作。同时，该杂交体系支持多杂：同一杂交反应可完成至高 12 例样本的富集。

 Figure 8
图 8. NadPrep® ES Hybrid Capture Reagents 工作流程


5.4 一站式生信分析，破解 DRB3/4/5 分析难题


DRB 常见的单倍型有 5 种。HLA-HD 等开源软件面对复杂的 DRB 3/4/5 基因分型时还需人工结合 DRB 单倍型进行综合判读。XCapViz 生信分析系统在准确判读常规 HLA 基因分型之外，还针对 DRB 基因分型做出了针对性的优化，可自动根据常见的 DRB 单倍型正确判读 DRB 3/4/5 基因分型，助力 HLA 分型自动化。
Figure 9 
图 9. HLA 分型原理


06 测试总结


纳昂达 HLA 分型全流程解决方案经过优化设计，大大缩短了液相杂交捕获富集所需时间，简化了操作流程，搭配纳昂达 XCapViz 生信分析系统为高质量 HLA 分型提供样本到报告的全流程检测支持。
方案搭配华大智造三款测序平台在参考品测试中均表现出高分型准确率。其中，DNBSEQ-E25 小巧灵活、开箱即用，测序迅速准确且无需清洗，完美适配 HLA 分型检测场景的需求。组合使用更有助于优化 TAT，为免疫、移植等领域的研究带来更多助力！

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