更好地实现HLA分型，原来可以这样做......

HLA（人类白细胞抗原，Human Leukocyte Antigen）由 6 号染色体上一类编码 MHC（主要组织相容性复合体，Major Histocompatibility Complex）基因生成。HLA 以高度的多态性成为人类重要的遗传标记，在免疫应答和调控中发挥着重要作用。HLA 等位基因的分类命名法由 WHO HLA系统命名委员会确定，数据库中已正式命名的 HLA-I 型（HLA-A、B、C）和 HLA-II 型（HLA-DRB、DQB1等）等位基因，已达到 31675个 (IMGT / HLA 数据库 2022.01)。

HLA 与许多自身免疫性和传染性疾病的敏感性和耐药性有关。近期有研究称 HLA-A*24 型人群的 T 细胞对新冠病毒免疫反应更强^[1]。HLA 配型相合程度，是器官、骨髓和干细胞移植成功与否的关键因素。此外，肿瘤患者的 HLA 基因型以及肿瘤中的体系突变均有可能影响免疫治疗的疗效。

图 1. HLA等位基因的分类命名法

尽管一代测序法是当前 HLA 分型的主要方法，已应用于 HLA 组织配型实验室和各临床医院，但通量低和耗时长是主要缺点。其次，一代测序分离杂合标本中的 HLA 等位基因序列也需要更为复杂昂贵的方式才能实现。二代测序由于通量和速度的极大提升，单次分型即可完成产生全相的高分辨率 HLA 分型，因而迅速得到广泛应用。

基于探针杂交捕获的二代测序，可高通量、低成本的实现高分辨 HLA 分型。相较于基于 PCR 的靶标序列富集方式，杂交捕获对于序列多态性的高容忍度是一个突出的优势。但是在面对 HLA 这样的超高多态性靶标时，杂交捕获也可能会力有不逮。纳昂达针对这一挑战专门开发了多态性探针补充方案，以最少的探针数覆盖 HLA 数据库中的数万种 HLA 型别，保证各种型别都有错配数 ≤7 的探针可结合（图 2A）。如图 2B 所示，常规设计对杂合子文库的捕获效果不佳，HLA-DQB1 中的部分位点多态性出现丢失情形。而经多态性补充后的探针，可顺利捕获两种等位基因。

图 2. 纳昂达多态性探针补充方案

HLA 分型的标准品为 UCLA Immunogenetics Center 的细胞系标准品 UCLA DNA Reference Panel，包含 24 种 Class I 和 12 种 Class II。HLAtyping Panel v1.0 靶向一系列 HLA 基因及免疫通路基因，覆盖基因组约 40 kb 区域。靶向捕获测序均在 Illumina 和 MGISEQ 双平台上进行，参考相应使用说明。涉及试剂见表 1。

表 1. 靶向捕获试剂信息

HLA-HD^[2]、Athlates^[3] 和OptiType^[4] 软件应用于HLA分型的分析（表 2）。其中 HLA-HD 和 Athlates 可用于 HLA I 型和 II 型的分型, HLA-HD 可以一次性对所有 HLA I 型和 II 型进行分型鉴定，而 Athlates 每次只能对一种分型进行鉴定。OptiType 只能用于 HLA I 型分型且精度为 4 位。如无特别说明，三者使用的数据库版本均为 IPD-IMGT/HLA，版本号 3.37.0。

表 2. 分析软件列表

HLA I 型和 II 型的标准品构建的双平台文库经 HLAtyping Panel 捕获，覆盖区域的平均深度均 >500x，平均中靶率均>75%（图3）。由于 HLA 区域的多态性和高复杂度，在评估捕获数据时，我们仅选取主要染色体进行基因组比对。如果把参考基因组补丁纳入范围，将导致“脱靶”率较高。但无论哪种方式，均不影响后续的 HLA 分型。

图 3. HLAtyping Panel双平台捕获结果

我们首先使用 HLA-HD、Athlates 和 OptiType 对 HLA 的 I 型和 II 型共计 12 个标准品分析，具体结果见表 3。HLA-HD 和 Athlates 比 OptiType 的 HLA I 型分型更加准确，两者仅在 A 基因的 24 个 allele 上错误分型 1 个位点，而 OptiType 则在 A 和 C 基因上分型错误了 2 个和 1 个位点。而 HLA 的 II 型分型的结果来看 HLA-HD 和 Athlates 各有优劣，HLA-HD 在 DRB3/4/5 基因上分型上错误了 4 个位点，而 Athlates 则在 DPB1 基因上效果不佳，错误了 3 个位点的分型。

表 3. 12个标准品的HLA分型结果

进一步分析 HLA-HD 分型不准确的原因，我们发现主要原因在于使用 IMGT 数据库版本的差异。以 HLA I 型的 C1-106 样本为例，A 基因的一个 Allele 位点跟标准品的 HLA-A*02:01 不一致，而是 HLA-A*02:642。但当使用更早的 IMGT 数据库版本（3.32.0）分析时，HLA-HD 的分型的结果为 HLA-A*02:01:01,与标准品的分型相一致。实际上 HLA-A*02:642 在 IMGT 3.37 版中属于 HLA-A*02:01:01G group，也就是说 HLA-A*02:642 分型是正确的，只不过由于 IMGT 数据库新增分型产生了命名差异。存在此现象的还包括 C2-104、C2-112 样品，具体分型结果和说明见表 4。

由于 HLA-HD 未过滤去除比对质量低且局部深度较低的读长，C2-106 样本被错误判定为杂合子，增加了HLA-DRB5*01:20 分型。Athlates 可对 C2-106 样本进行正确的分型，不存在误判，也从侧面证明了这一点。

HLA-HD 和 Athlates 软件均将 C2-105 中 HLA-DQA1*05:01 分型为 HLA-DQA1*05:05:01，原因在于后者的匹配度更高。对于这一偏差，我们认为应当使用一代测序验证相应突变位点，再次判别。

表 4.  HLA-HD的“错误”分型原因

我们使用 HLA-HD 和 Athlates 对 HLA I 型的 24 个标准品分析，具体结果见表 5 和 6。整体而言，HLA-HD 比 Athlates 的 HLA I 型分型更加准确，前者仅在 C 基因的 48 个 allele 上“错误”分型 2 个位点，而 Athlates 则在 A 和 C 基因上分型错误了 3 个和 4 个位点。但当使用更早的 IMGT 数据库版本（3.32）的时候，HLA-HD 的分型的结果与标准品参考分型完全一致。因此，在使用 NGS 进行 HLA 分型时，需考虑 IMGT 数据库更新的影响。

表 5.  24个标准品的HLA分型结果

表 6.  HLA-HD的“错误”分型原因

NGS已经被证明可以有效减少 HLA 分型的不准确性和检测成本，同时还能检测 HLA 基因的全部信息。但面对日益增多的测序数据和不断更新的 IMGT/HLA 的数据库，如何从 NGS 数据中得到正确的 HLA 分型变得越来越重要。

当使用多态性优化设计的 HLAtyping Panel 进行双平台捕获测序时，不同分析软件下的 Call rate 均能达到 100%，36 种 HLA 标准品合计 72 个 Allele 的分型准确率也在 98.5% 以上。即使平均测序深度低至 50x 时，也依然可以达到上述指标，这表明捕获数据均一性较好，不存在因某些 HLA 基因缺失或捕获质量差，导致无法分型的情形。

尽管 HLA-HD 软件在 HLA 分型时表现更好，但依然存在错误分型的可能。与此同时 HLA 数据库的不同版本也对软件判断分型的结果带来了巨大的影响。因此，在实际应用中，应根据 HLA 变异数据库的特定人群频率和单倍型频率进行校正，进一步提高分型准确率。

参考文献：

[1] https://www.riken.jp/en/news_pubs/research_news/pr/2021/20211208_1/index.html

[2] Kawaguchi S, Higasa K, Shimizu M, et al. HLA‐HD: An accurate HLA typing algorithm for next‐generation sequencing data[J]. Human mutation, 2017, 38(7): 788-797. 

[3] Liu C, Yang X. Using exome and amplicon-based sequencing data for high-resolution HLA typing with ATHLATES[M]//HLA Typing. Humana Press, New York, NY, 2018: 203-213. 

[4] Szolek A, Schubert B, Mohr C, et al. OptiType: precision HLA typing from next-generation sequencing data[J]. Bioinformatics, 2014, 30(23): 3310-3316.