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LungCancer Panel
#1001921 (96 rxn)
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基因列表
编码区覆盖
ALK
BRAF
CD274
CD74
EGFR
ERBB2
EZR
FGFR1
FGFR2
FGFR3
KRAS
MET
NRAS
NTRK1
NTRK2
NTRK3
NUTM1
PDCD1LG2
PDGFRA
PIK3CA
RET
ROS1
SDC4
SLC34A2
注：加粗基因覆盖全部编码区域。
产品表现
表1. LungCancer Panel v1.0 捕获表现
|
测序平台 |
捕获效率
（%） |
重复率（%） |
% target
> 0.2 x mean |
% target
> 0.5 x mean |
% target
> 1 x mean |
Fold 80 base penalty |
|
MGI |
92.75 |
6.20 |
99.21 |
96.21 |
52.12 |
1.28 |
|
Illumina® |
93.98 |
12.21 |
99.98 |
97.92 |
52.14 |
1.27 |
本产品仅限研究使用，不用于临床诊断。
|
货号 |
管盖
颜色 |
产品名称 |
包装
体积 |
包装/储存温度 |
|
1001922 |
|
LungCancer Panel v1.0, 16 rxn |
70 μL |
–20℃ |
|
1001921 |
|
LungCancer Panel v1.0, 96 rxn |
415 μL |
–20℃ |
推荐如下：
• 对于 Size 分布均一、所需测序数据量相同的文库，一般在文库混杂投入比＞50 % 的前提下，推荐 500 ng/文库的投入量，以期提高文库丰富度，降低测序数据的重复率；
• 对于 Size 分布不均一、样本质量差异较大、所需测序数据量不同的文库，一般在文库混杂比＞50 % 的前提下，推荐按照摩尔量进行相应比例的混合。
注：1. 混杂投入比=样本进入杂交反应的文库量/样本实际文库构建产出总量*100 %；
2. moles of dsDNA (mol) = mass of dsDNA (g) / ((length of dsDNA (bp) x 617.96 g/mol) + 36.04 g/mol)
目前混合文库的浓缩推荐采用真空浓缩法或磁珠浓缩法，具体操作可参考DNA文库杂交捕获操作指南。相关测试结果表明不同浓缩法的结果基本一致，仅存在轻微GC差异偏好。但真空法更经济、操作简单，而磁珠法则可适配自动化工作站，可根据具体情况进行选择：
|
浓缩方式 |
优点 |
缺点 |
|
真空浓缩 |
操作简便、时间可控、损失低 |
需要真空浓缩仪 |
|
磁珠浓缩 |
无需另购仪器、可适配自动化工作站 |
存在DNA损失且需求试剂量增加、存在GC偏好性 |
捕获终文库得量与许多因素存在相关性，除去实验操作影响外，一般会有以下理论影响因素：样本类型、起始混杂文库总量、Panel 大小、杂交时长、扩增循环数等。为获得良好的实验数据，在满足上机测序所需用量的前提下，应尽量控制捕获后扩增循环数。Illumina®平台在上机测序前会对文库进行指数式扩增的成簇反应，故所需的上机文库总量较低（具体需要根据各测序仪型号以及测序公司要求决定）。对于不同 Panel，可在实验初期参考以下推荐列表，后期再根据具体结果进行调整：
|
Panel大小 |
1-plex （500 ng） |
4-plex （2,000 ng） |
8-plex （4,000 ng） |
12-plex （6,000 ng） |
|---|---|---|---|---|
|
＞10 Mb |
10 cycles |
8 cycles |
7 cycles |
6 cycles |
|
1 Mb-10 Mb |
12 cycles |
10 cycles |
9 cycles |
8 cycles |
|
50 Kb- 1Mb |
13 cycles |
11 cycles |
10 cycles |
10 cycles |
|
1 Kb-50 Kb |
14 cycles |
12 cycles |
11 cycles |
11 cycles |
针对纳昂达商品化 Panel，可参考下表进行选择：
|
Panel名称 |
大小 |
混杂 |
Post-Capture 扩增循环数 |
捕获文库产出（ng） |
|---|---|---|---|---|
|
Exome Plus Panel 2.0 |
~46 Mb |
1-plex（500 ng） |
8 |
~70 |
|
12-plex（6,000 ng） |
6 |
~200 |
||
|
NanOnco Plus Panel v2.0 |
~2.6 Mb |
1-plex（500 ng） |
10 |
~120 |
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
||
|
NanoHema Research Panel v1.0 |
~1 Mb |
1-plex（500 ng） |
11 |
~70 |
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
||
|
NanOnCT Panel v1.0 |
~0.4 Mb |
1-plex（500 ng） |
12 |
~80 |
|
12-plex（6,000 ng） |
8 |
~80 |
||
|
LungCancer Panel v1.0 |
~0.23 Mb |
1-plex（500 ng） |
14 |
~100 |
|
12-plex（6,000 ng） |
11 |
~70 |
捕获终文库得量与许多因素存在相关性，除去实验操作影响外，一般会有以下理论影响因素：样本类型、起始混杂文库总量、Panel大小、杂交时长、扩增循环数等。为获得良好的实验数据，在满足上机测序所需用量的前提下，应尽量控制捕获后扩增循环数。MGI测序平台需要在上机前对文库进行环化，接着再进行滚环式扩增成DNA纳米球（DNA Nanoball）的过程。故所需的上机文库总量高于Illumina® 平台（具体需要根据各测序仪型号以及测序公司要求决定）。根据NadPrep®通用环化试剂盒（for MGI）(货号：1002231）使用说明书V1.0版本描述，环化所需文库推荐投入量至少＞1 pmol，因此我们推荐：
• 对于大型Panel的多样本混杂文库，由于可能所测数据量较多，建议至少需要满足＞1 pmol的总量（＞300 ng）；
• 对于大型Panel的少量样本混杂文库，由于后续会与其他文库混合上机测序，所需文库总量可适当降低。但建议混合送测文库总量＞1 pmol（＞300 ng）；
对于小型Panel的混杂文库，由于后续会与其他文库混合上机测序，所需文库总量可适当降低。但建议混合送测文库总量＞1 pmol（＞300 ng）。
基于上述总量，针对特定类型的Panel，可根据测试结果调整捕获后扩增循环数。针对纳昂达商品化Panel，可参考下表：
|
Panel名称 |
大小 |
混杂 |
Post-Capture扩增循环数 |
捕获文库产出（ng） |
|
Exome Plus Panel 2.0 |
~46 Mb |
1-plex（500 ng） |
8 |
~70 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
6 |
~200 |
|
NanOnco Plus Panel v2.0 |
~2.6 Mb |
1-plex（500 ng） |
10 |
~120 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
|
NanoHema Research Panel v1.0 |
~1 Mb |
1-plex（500 ng） |
11 |
~70 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
|
NanOnCT Panel v1.0 |
~0.4 Mb |
1-plex（500 ng） |
12 |
~80 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
8 |
~80 |
|
LungCancer Panel v1.0 |
~0.23 Mb |
1-plex（500 ng） |
14 |
~100 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
11 |
~70 |
说明：以上为纳昂达针对gDNA或标准品在16 h杂交时长下的经验循环数及产出。不同实验室因样本类型、实验条件、实验环境不同可能有所差异。
针对NadPrep®系列产品，在文库构建及靶向捕获时的扩增引物如下：
|
接头类型 |
Pre-Capture 扩增引物 |
Post-Capture 扩增引物 |
测序平台 |
|---|---|---|---|
|
NadPrep®UDI Adapter |
NadPrep®Amplification Primer Mix |
NadPrep®Amplification Primer Mix |
Illumina®平台 |
|
NadPrep®M-Adapter / BMI Adapter (SI) |
NadPrep®M-Index Primer Mix (SI) |
M-Amplification Primer Mix (SI) |
MGI平台 |
|
NadPrep®M-Adapter / BMI Adapter (DI) |
NadPrep®M-Index Primer Mix (MDI) |
M-Amplification Primer Mix (DI) |
MGI平台 |
|
NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) |
NadPrep® Universal UDI-Index Primer Mix |
Amplification Primer Mix Ⅱ |
Illumina®/MGI 平台 |
NadPrep®通用型文库构建试剂盒（96 rxn）已包含 Pre/Post-Capture 的相关引物。其中 Post-PCR 引物均为 Illumina 或 MGI 平台通用引物，也可使用其它同类型产品替代。
为了解除带有生物素标记的文库与链霉亲和素磁珠的结合，可尝试使用以下二者操作之一（或参考 M270 磁珠官方建议）：
• 溶于 10 mM EDTA、95% 甲酰胺、pH 8.2 的溶液中，混匀并于 65℃下加热 5 min或 90℃下加热 2 min；
• 溶于 0.1 % SDS，混匀并加热煮沸 5 min。
尽管杂交捕获体系已经过优化，适用于更短时间的杂交。但与 16 h 杂交相比，不同类型的 Panel 随着杂交时长的缩短，在捕获文库总量、捕获效率、覆盖均一性等方面皆存在不同程度的降低，详见下图。相比中大型 Panel（＞0.4 Mb），小型 Panel（＜0.4 Mb）受到的影响更大。对于有时效性要求的，可对大型 Panel 尝试缩短杂交时间，但不建议将此种情况用于小型 Panel。
|
产品 |
货号 |
|
LungCancer Panel v1.0, 16 rxn |
1001922 |
|
LungCancer Panel v1.0, 96 rxn |
1001921 |
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应用指南
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