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NEX-t Panel v1.0
#1001971
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方案推荐
方案表现
独具匠心的设计
(1) 针对表 1. 中病毒、细菌、真菌、寄生虫在内的数百个物种的特征序列设计的探针；
● 比较种或属下的多个参考序列，选取其中处于探针容错范围内，且包含一定多样性的区域
● 参考多位点序列分型 (MLST) 所涉及的序列
● 结合相关文献
(2) 针对 16S/ITS 设计的少量泛用性探针；
● 参考多个数据库 (SILVA，Greengenes，RDP，Unite)
(3) 针对耐药、毒力等相关基因设计的探针。
表 1. NEX-t Panel v1.0 主要涉及的病原物种
类别
病原体
革兰氏阳性菌
缺陷乏养菌, 脲放线杆菌, 马杜拉放线菌, 伊氏放线菌,
芽孢杆菌, 短杆菌, 艰难梭菌, 梭菌, 棒状杆菌, 痤疮丙酸杆菌 , 肠球菌, 丹毒丝菌, 阴道加德纳菌, 孪生球菌, 戈登氏菌, 颗粒链菌,
考克氏菌, 肠膜明串珠菌, 单增李斯特氏菌, 藤黄微球菌, 分枝杆菌, 诺卡菌, 厌氧消化链球菌, 红球菌, 黏液罗氏菌, 葡萄球菌, 链球菌,
苏黎世菌, 小韦荣球菌
革兰氏阴性菌
木糖氧化无色杆菌, 鲍曼不动杆菌, 气单胞菌, 凝聚杆菌,
粪产碱菌, 赫尔曼亚特兰大杆菌, 脆弱拟杆菌, 杆状巴尔通体, 博得特氏菌, 短螺旋菌, 缺陷短波单胞菌, 布鲁氏杆菌, 伯克霍尔德菌, 空肠弯曲菌,
犬咬二氧化碳嗜纤维菌, 人类心杆菌, 吲哚金黄杆菌, 柠檬酸杆菌, 睾丸酮丛毛单胞菌, 害肺小杆菌, 迟缓爱德华氏菌, 侵蚀艾肯菌, 伊丽莎白菌,
阴沟肠杆菌, 埃希氏菌, 美洲爱文菌, 土拉热弗朗西斯菌, 梭杆菌, 流感嗜血杆菌, 蜂房哈夫尼菌, 金氏菌, 克雷伯菌, 军团菌, 纤毛菌, 莫拉氏菌,
摩根氏菌, 奈瑟氏菌, 成团泛菌, 巴氏杆菌, 类志贺邻单胞菌, 牙龈卟啉单胞菌, 二路普氏菌, 变形杆菌, 普罗威登斯菌, 伤口假埃希氏菌, 假单胞菌,
解甘露醇罗尔斯顿菌, 皮氏罗尔斯顿菌, 拉乌尔菌, 沙门氏菌, 沙雷氏菌, 海藻希瓦氏菌, 宋内志贺菌, 鞘氨醇杆菌, 嗜麦芽窄食单胞菌, 惠普尔养障体,
解藻弧菌, 霍乱弧菌, 创伤弧菌, 耶尔森氏菌
螺旋体
疏螺旋体, 钩端螺旋体, 梅毒螺旋体
专性胞内寄生
嗜吞噬细胞无形体, 衣原体, 柯克斯体, 埃立克体, 支原体,
恙虫病东方体, 立克次体, 解脲支原体
真菌
链格孢属, 曲霉, 皮炎芽生菌, 念珠菌, 枝孢霉,
葡萄牙念珠菌, 球孢子菌, 隐球菌, 皮炎外瓶霉, 着色霉, 镰刀菌, 荚膜组织胞浆菌, 伞枝横梗霉, 头状双足囊菌, 糠秕马拉色菌, 季也蒙迈耶氏酵母,
小孢子菌, 毛霉菌, 罗伦特隐球菌, 青霉菌, 耶氏肺孢子菌, 微小根毛霉, 根霉菌, 红酵母, 赛多孢子菌, 孢子丝菌, 葡萄穗霉, 木霉, 丝孢酵母,
奔马赭霉, 异常威克汉姆酵母
寄生虫
棘阿米巴, 广东住血线虫, 异尖线虫, 似蚓蛔线虫, 巴贝虫,
马来丝虫, 华支睾吸虫, 隐孢子虫, 环孢子虫, 棘球绦虫, 脑胞内原虫, 溶组织内阿米巴, 蠕形住肠线虫, 肝片形吸虫, 短膜壳绦虫, 利什曼原虫,
奈格勒虫, 泰国肝吸虫, 并殖吸虫, 疟原虫, 日本血吸虫, 绦虫, 结膜吸吮线虫, 弓形虫, 旋毛虫, 阴道毛滴虫, 鞭虫, 班氏吴策线虫
DNA 病毒
腺病毒, 指环病毒, 疱疹病毒, 细小病毒, 多瘤病毒,
痘病毒, 细环病毒
RNA 病毒
阿尔法病毒, 星状病毒, 布尼亚病毒, 冠状病毒,
丁型逆转录病毒, 黄病毒, 流感病毒, 狂犬病毒, 诺如病毒, 正呼肠孤病毒, 副粘液病毒, 小核糖核酸病毒, 肺炎病毒, 轮状病毒, 札幌病毒
不同微生物含量样本的捕获表现
图 2. NEX-t
Panel v1.0 对不同微生物含量的模拟菌群样本的捕获表现。50
ng Input 以 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v2 建库，利用 NEX-t Panel v1.0 搭配 NadPrep® ES Hybrid Capture Reagents 完成杂交捕获 (杂交 2 hr)。测序模式为 Novaseq6000， PE150。利用 BWA 比对到由 hg19 人类基因组和 20 种微生物基因组参考序列组成的参考基因组，统计 reads 分布。A. 中靶率；B. 捕获 reads 分布。
注：样本来源为以人类基因组 DNA 标准品 (Promega，G1471) 按照不同比例对 20 菌株交错的混合基因组材料 (ATCC，MSA-1003) 进行稀释，以获得 0.001%-1% MSA-1003 的模拟菌群。
出色的灵敏度
RNA-To-DNA 模块
/
/
包装编号
管盖颜色
组分名称
包装体积
1002401 (24 rxn)
包装体积
1002402 (96 rxn)
Box1
1st Strand Synth.
Buffer
120 µL
460 µL
Random Primer
30 µL
115 µL
1st Strand Synth.
Enzyme
60 µL
230 µL
2nd Strand Synth.
Buffer
810 µL
2×1550 µL
2nd Strand Synth.
Enzyme
90 µL
345 µL
Nuclease Free Water
2.5 mL
8 mL
Box2
NadPrep SP Beads
2.5 mL
10 mL
通用建库模块
/
/
包装编号
管盖颜色
组分名称
包装体积
1002101 (24 rxn)
包装体积
1002103 (96 rxn)
Box1
EndRepair & A-Tailing Buffer
180 µL
690 µL
End Repair & A-Tailing Enzyme
120 µL
460 µL
Ligation Buffer
750 µL
2×1500 µL
DNA Ligase
65 µL
250 µL
2X HiFi PCR Master Mix
720 µL
2×1600 µL
NadPrep
Amplification Primer Mix II
145 µL
650 µL
Nuclease Free Water
2.5 mL
8 mL
TE Solution
1 mL
4 mL
Box2
NadPrep SP Beads
4 mL
15 mL
酶切建库模块
| 包装编号 | 管盖颜色 | 组分名称 |
包装体积 1002601(24 rxn) |
包装体积 1002602 (96 rxn) |
| Box1 |
|
FERA Buffer | 150 µL | 575 µL |
|
|
FERA Enzyme | 150 µL | 575 µL | |
|
|
Enhancer Buffer | 250 µL | 950 µL | |
|
|
Ligation Buffer | 750 µL | 2×1500 µL | |
|
|
DNA Ligase | 60 µL | 230 µL | |
|
|
2X HiFi PCR Master Mix | 720 µL | 2×1600 µL | |
|
/ |
Nuclease Free Water | 2.5 mL | 8 mL | |
|
|
TE Solution | 1 mL | 4 mL | |
| Box2 |
/ |
NadPrep SP Beads | 4 mL | 15 mL |
通用截短型双端唯一接头模块
| 管盖颜色 | 组分名称 |
包装体积 1003240 (24 rxn) |
包装体积 1003241 (96 rxn) |
包装体积 1003242 (96 rxn) |
|
|
NadPrep Universal UDI-index Primer Mix # | 12×15 µL (Tube) | 24×25 µL (Tube) | 24×25 µL (Tube) |
|
|
NadPrep Universal Stubby Adapter | 60 µL (Tube) | 230 µL (Tube) | 230 µL (Tube) |
|
|
NadPrep Amplification Primer Mix II | 20 µL (Tube) | 75 µL (Tube) | 75 µL (Tube) |
| 管盖颜色 | 组分名称 |
包装体积 1003251 (96 rxn) |
包装体积
1003252 (96 rxn) |
包装体积
1003253 (96 rxn) |
包装体积
1003254 (96 rxn) |
|
|
NadPrep Universal UDI-index Primer Mix # | 96×8 µL (Plate) | 96×8 µL (Plate) | 96×8 µL (Plate) | 96×8 µL (Plate) |
|
|
NadPrep Universal Stubby Adapter | 260 µL (Tube) | 260 µL (Tube) | 260 µL (Tube) | 260 µL (Tube) |
|
|
NadPrep Amplification Primer Mix II | 75 µL (Tube) | 75 µL (Tube) | 75 µL (Tube) | 75 µL (Tube) |
| 管盖颜色 | 组分名称 |
包装体积 1003261 (1152 rxn) |
包装体积
1003262 (1152 rxn) |
包装体积
1003263 (1152 rxn) |
包装体积 1003264 (1152 rxn) |
|
|
NadPrep Universal UDI-index Primer Mix # | 96×72 µL (Tube) | 96×72 µL (Tube) | 96×72 µL (Tube) | 96×72 µL (Tube) |
|
|
NadPrep Universal Stubby Adapter | 2×1350 µL (Tube) | 2×1350 µL (Tube) | 2×1350 µL (Tube) | 2×1350 µL (Tube) |
|
|
NadPrep Amplification Primer Mix II | 900 µL (Tube) | 900 µL (Tube) | 900 µL (Tube) | 900 µL (Tube) |
封阻序列
包装体积
1006101 (16 rxn)
包装体积
1006102 (96 rxn)
管/瓶盖颜色
名称
NadPrep® NanoBlockers (for Illumina®)
40 μL
210
μL
杂交捕获试剂
| 包装编号 | 管/瓶盖颜色 | 名称 |
包装体积 1005402 (16 rxn) |
包装体积 1005401 (96 rxn) |
| Box 1 |
|
ES Hyb #1 | 380 μL | 2×1150 μL |
|
|
Hyb #2 | 120 μL | 720 μL | |
|
|
Human Cot DNA | 110 μL | 650 μL | |
|
/ |
ES Wash Buffer | 4×4 mL | 5×19 mL | |
|
|
Sealing Oil | 250 μL | 1.5 mL | |
| Box 2 |
/ |
Streptavidin Beads | 950 μL | 5.7 mL |
捕获 Panel
| 货号 | 管盖颜色 | 产品名称 | 包装体积 |
| 1001972 |
|
NEX-t Panel v1.0, 16 rxn | 70 μL |
| 1001971 |
|
NEX-t Panel v1.0, 96 rxn | 415 μL |
临床标本的质量直接影响检测结果。不同标本类型受定植菌影响的程度不同，由此导致 tNGS 检测结果的可信度存在差异。
不同类型的临床标本采集要求
| 样本类型 | 样本量 | DNA 样本要求 | RNA 样本要求 | ||||
| 采集容器 | 储存条件 | 运输条件 | 采集容器 | 储存条件 | 运输条件 | ||
| 血液 | ≥ 10 mL | 保存液采血管 | 4℃ 保存一周 | 冰袋低温运输 | 保存液采血管 | 4℃ 保存一周 | 冰袋低温运输 |
| 肺泡灌洗液 | ≥ 10 mL | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 |
| 痰液 | ≥ 3 mL | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 |
| 脑脊液 | ≥ 2 mL | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 |
| 胸水 | ≥ 25mL | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 |
| 腹水 | ≥ 25 mL | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 |
| 骨髓 | ≥ 0.5 mL | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 |
| 其他体液 | ≥ 10 mL | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 |
| 粪便 | 黄豆粒大小 | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 | 无菌螺旋管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 |
| 拭子 | ≥ 3支 | 保存液采样管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 | 保存液采样管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 |
| 新鲜组织 | 米粒大小 | 组织采样管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 | 组织采样管 | -80℃ 长期保存 | 干冰运输 |
主要信息来源于《高通量测序技术在分枝杆菌病诊断中的应用专家共识》。
核酸提取的质量是决定高通量测序检测成功的关键，不同的操作实验室都应建立完整的核酸提取流程。首先要对选取的核酸提取试剂盒进行验证，以确保核酸提取的效率及完整性，并对每次提取的核酸样本进行定量检测，以确保核酸满足后续实验要求，同时建立合格核酸样本的标准。
核酸质量验证：
(1) 高质量的 DNA A260/A280 应在 1.7~1.9，A260/A230 应 > 2，可用 1% 琼脂糖凝胶电泳验证 DNA 的质量 (无杂带、无拖尾、背景无蛋白污染)。
(2) DNA 完整性 (如 Agilent 2100 Bioanalyzer) 检测，如果大部分片段在 200 nt (血浆游离 DNA 除外，140 nt) 以下说明 DNA 降解严重，需重提。
(3) 高质量的 RNA A260/A280 应在 1.8~2.0，A260/A230 应 > 2。
(4) 微量的核酸采用 Qubit 荧光染料法进行定量测定。
综上，在临床样本采集时确保足量的的样本进行核酸提取，以获得更高丰度的核酸样本；tNGS 构建的文库中含有的病原微生物的丰度越高，则 tNGS 检测LOD 更低，低载量病原微生物也能够高效检出。
主要信息来源于《高通量测序技术在分枝杆菌病诊断中的应用专家共识》和《高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识》。
实际测序获得的数据量跟临床标本中病原微生物的含量有关；是否出报告具体是根据检测到的病原的支持 reads 数，与测序获得的总数据量无关。若预测可信的病原微生物在报告中显示未检出，即使在数据量足够的情况下，也可建议增加数据量再进行生信分析或采取 PCR 进行验证；相反，若测序获得的数据量极低，但是检测到了足够数据量支持的病原微生物，也同样会出报告。
- 一般来说，对病原微生物基因组进行完整的探针覆盖是无法实现的。一方面是由于在考虑参考基因组以外的序列多态性时，一种细菌所需的探针即可达数十万条；另一方面是由于当病原序列与宿主序列存在一定相似性时，为防止脱靶，需要舍弃这些区域。因此，NEX-t Panel v1.0 在探针设计时侧重于以最少的探针实现最多的病原分析功能，panel 规模相比于常见的杂交捕获 tNGS 方案大为精简。
- 探针条数可近似等效于多重扩增子的扩增子个数，但由于探针具有更高的容错性，同时还能捕获到探针侧翼的序列；因此，一定数量的探针可获得比相似扩增子个数的多重扩增更丰富的信息。
- 与多重扩增子相比，杂交捕获 Panel 的扩展更为简单，只需增加探针。因此，NEX-t Panel v1.0 可以方便地进行定制和组合升级。
- NEX-t Panel v1.0 推荐与 NadPrep®️ ES Hybrid Capture Reagents 快杂试剂搭配，可有效缩短杂交时间，简化实验步骤；
- 杂交捕获测序比多重扩增子测序更为稳定，失败率更低。
- 病原捕获的中靶率受到病原含量的影响较大。如下图所示，在相同的宿主背景下，随着微生物参考品的梯度稀释，其数据量呈等比例下降的趋势，而中靶率也随之降低。
- 尽管多轮捕获能够显著地提高中靶率，但这种策略同时伴随着信息丢失 (dropout) 的风险。尤其在病原含量较低的情况下，中靶率低，同时也对 dropout 更为敏感。因此，在考虑多轮捕获时需要谨慎权衡利弊。此外，从另一个角度来看，当样本中的病原基因组拷贝数为个位数时，提高中靶率实际上只是将这几个拷贝反复测序，并未产生更多的有用信息。
注：以人类基因组
DNA 标准品
(Promega，G1471)
按照不同比例对 20 菌株交错的混合基因组材料
(ATCC，MSA-1003) 进行稀释以获得 0.001%-1% MSA-1003 的模拟菌群样本。50 ng Input 以 NadPrep® 快速
DNA 酶切文库构建试剂盒
v2 建库，利用
NEX-t Panel v1.0 搭配 NadPrep®️ ES Hybrid Capture Reagents 完成杂交捕获 (杂交
2 h)。测序模式：Novaseq6000，
PE150。
测序数据利用 BWA 比对到由 hg19 人类基因组和 20 种微生物基因组参考序列组成的参考基因组，统计 reads 分布。
- 如下图所示，对于不同微生物含量的样本，检出下限均在 3 拷贝附近。实际使用时，灵敏度主要由建库投入量决定。需要注意的是，文库制备存在转化率的制约因素，不是所有拷贝都能成功转化。与之类似，当拷贝数为个位数时，多重扩增子的扩增成功率也会降低。
- 此外，拷贝数小于 1 并不意味着无法被检出，这是因为 NEX-t Panel v1.0 在一个物种存在多个探针捕获区域时，其拷贝数可以累加，从而提高检测灵敏度。
由于不同样本中的病原含量差异较大，如果希望每个样本都获得相似的数据量，则无法混合杂交，只能单独杂交。不过如下图所示，当样本中微生物含量存在数量级的差异时，虽然数据量差异较大，但是对于低丰度的样本，其本身所需的数据量也相对较低。同时，不同样本之间由于使用相同的实验参数，具有相似的 PCR 重复率。如果将它们分别杂交捕获，并设置相同的测序量，则低丰度样本需要增加 PCR 循环数，相同的信息量只会以重复的形式组成提升的测序数据量，这是因为 Panel 捕获后测序更容易达到饱和。因此，对于具有相似来源的样本，我们建议是可以进行混合杂交的。
- 支持。RNA 病毒和 DNA 病毒可以采用共建库的方式制备预文库，然后再进行捕获；也可以分别制备 RNA 文库和 DNA 文库，混合后杂交。一般来说 RNA 文库不需要进行宿主核糖体 RNA 的去除。
- 下图示例展示了含有流感病毒 (H10N3) 的 RNA 文库与 DNA 文库共杂交的捕获情况。共计 15 个文库中包含了 11 个 DNA 文库和 4 个 RNA 文库。示例文库数据量为 100 Mb (15 个文库总数据量为 9.3 Gb)，其中宿主序列占比为 58.3%。
| 类别 | 产品名称 | 规格 | 货号 |
| RNA-To-DNA | NadPrep®️ Total RNA-To-DNA Module, 24 rxn | 24 rxn | 1002401 |
| NadPrep®️ Total RNA-To-DNA Module, 96 rxn | 96 rxn | 1002402 | |
| 建库模块 | NadPrep® DNA Library Preparation Kit (for Illumina®) G24 | 24 rxn | 1002101 |
| NadPrep® DNA Library Preparation Kit (for Illumina®) E96 | 96 rxn | 1002103 | |
| NadPrep® EZ DNA Library Preparation Module v2, 24 rxn | 24 rxn | 1002601 | |
| NadPrep® EZ DNA Library Preparation Module v2, 96 rxn | 96 rxn | 1002602 | |
| 接头模块 | NadPrep® Universal Syubby Adapter (UDI) Module Set A1, 24 rxn | Index 1-12 | 1003240 |
| NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module Set B1, 96 rxn | Index 1-24 | 1003241 | |
| NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module Set B2, 96 rxn | Index 25-48 | 1003242 | |
| NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module Set E1, 96 rxn | Index 1-96 | 1003251 | |
| NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module Set E2, 96 rxn | Index 97-192 | 1003252 | |
| NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module Set E3, 96 rxn | Index 193-288 | 1003253 | |
| NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module Set E4, 96 rxn | Index 289-384 | 1003254 | |
| NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module Set F1, 1152 rxn | Index 1-96 | 1003261 | |
| NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module Set F2, 1152 rxn | Index 97-192 | 1003262 | |
| NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module Set F3, 1152 rxn | Index 193-288 | 1003263 | |
| NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module Set F4, 1152 rxn | Index 289-384 | 1003264 | |
| 封阻序列 | NadPrep® NanoBlockers (for Illumina®), 16 rxn | 16 rxn | 1006101 |
| NadPrep® NanoBlockers (for Illumina®), 96 rxn | 96 rxn | 1006102 | |
| 杂交捕获试剂 | NadPrep® ES Hybrid Capture Reagents, 16 rxn | 16 rxn | 1005402 |
| NadPrep® ES Hybrid Capture Reagents, 96 rxn | 96 rxn | 1005401 | |
| 捕获 Panel | NEX-t Panel v1.0, 16 rxn | 16 rxn | 1001972 |
| NEX-t Panel v1.0, 96 rxn | 96 rxn | 1001971 |
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