免疫组库是指某个个体在任何特定时间点其循环系统中所有功能多样性 B 淋巴细胞和T淋巴细胞的总和。T 细胞受体 (TR) 和 B 淋巴细胞特异表达的免疫球蛋白 (IG) 均具有特定的互补决定区 (CDR, complementarity-determining regions)，能与 MHC- 抗原肽分子进行识别并特异性结合，进而发挥功能清除病原体或体内肿瘤细胞。互补决定区的多样性是适应性免疫应答机制的重要基石。数量众多的 IG 和 TR 基因编码区段，通过 V(D)J 重排以及接合处进一步的碱基变化，提供了这种多样性。CDR 由 CDR1、CDR2 和 CDR3 组成，其中 CDR1 和 CDR2 经由 V 基因编码，CDR3 经由 V、D、J 编码形成，多样性最高。最初的免疫组库研究多聚焦于 CDR3。随着高通量测序技术的发展和成本降低，对免疫组库进行更为全面的分析势在必行。其结果已应用于评估治疗反应、对自身免疫多样性监控，甚至可作为 FDA 批准的 PD-1 治疗的伴随诊断。时下热门的 CAR-T 疗法以及 TCR-T 疗法更是离不开对 TCR 的研究和分析。
3 例 DNA 参考品分别来自于 Jurkat 细胞系 (T 细胞)、Ramos 细胞系的 (B 细胞) 和人类男性基因 DNA 混合样品 (Promega, G1471)。3 例 RNA 参考品分别来自于 Jurkat 细胞系、Ramos 细胞系和人类外周血白细胞 (WBC)。真实样本为 124 例队列研究人群，其中 26 例为健康人 DNA 样本 (CTR)，98 例为患者 DNA 样本 (CPC)。
DNA 和 RNA 样本分别采用纳昂达的 DNA 和 RNA 建库流程，以 IGTR Panel 进行捕获测序。其中，参考品的平均测序深度 > 700x，真实样本的平均测序深度 > 1,500x。具体文库构建和捕获试剂见下表：
测序数据下机后经 fastp 质控，然后使用 MiXCR[1] 进行 TCR 克隆型鉴定及统计，最后利用 VDJtools[2] 进行进一步的克隆统计分析。MiXCR 是常见分析免疫组库的生信软件之一，内置基于 GenBank 的人类和小鼠相应基因座的 V、D、J 和 C 基因序列库。它可以快速有效处理单双端测序数据，并一定程度上纠正 PCR 错误并识别胚系超突变。MiXCR 支持部分和全长免疫序列分析并使用所有可用的 RNA 或 DNA 信息，包括 V 基因片段上游和 J 基因片段下游的序列。VDJtools 则是一种对最常用免疫组库分析数据结果深度分析的框架工具软件，并允许应用一系列不同的高级分析策略。它的优势是确保高级分析方法的一致性和可重复性；节省分析免疫组库的时间且提供全面的表格输出和开源 API 。具体使用分析软件信息和流程分别见表2. 和图1. 。
目前大多数免疫组库分析方法仅聚焦于 TCR 的 β 链和 BCR 的重链，即对应的 TRB 和 IGH 基因。IGTR Panel 能捕获文库中覆盖 TCR/BCR (Ig) 的全部基因相关序列，因而可对 TCR/BCR 所有克隆亚型进行精准鉴定。
我们首先使用 MiXCR 软件对参考品的免疫组库克隆类型的定性和定量鉴定，具体结果如图2. 所示。Jurkat 细胞 (T 细胞) 主要由 TRA、TRB、TRD 和 TRG 构成，其中 TRB 占比较高。Ramos 细胞 (B 细胞) 主要由 IGH、IGK、IGL 构成，IGL 和 IGH 占比较高。而在混合 DNA 样本 (Promega, G1471) 和外周血白细胞 (WBC) 样本中，各种类型均有一定程度的占比。另外可发现，在同一种细胞系中 RNA 层面由于转录的多样性，可检出的克隆型种类数也显著高于 DNA 样本，如 Jurkat 细胞的 RNA 和 DNA 层面 TRB 种类数分别为 23 和 3。相应的，这也导致 RNA 层面链种类分布和克隆型数量分布都与 DNA 层面检测的结果存在巨大差异 (图2. B&D)。
图2. A&B. 各链型种类数统计结果; C&D. 各链型总 Count 数统计结果
Jurkat 细胞系为分化成熟程度高的 T 细胞，因此， TRB 重组种类数较少。TRB J 区无论在 DNA 和 RNA 层面，均只检测到一种克隆型 TRBJ1-2。尽管 V 区的 DNA 和 RNA 在克隆型种类频率方面也有较高的一致性。但是在低频克隆型种类的检出上，RNA 要优于 DNA (图3. A)。Ramos 细胞系作为分化成熟度高的 B 细胞，IGH 在 DNA 样本中仅检测到 IGHJ6-IGHV 4-34 一种克隆型，而在 RNA 样本中除 IGHJ6-IGHV4-34 外其他克隆型也有表达，但丰度极低 (图3. B)。
图3. 细胞系克隆型频率分布：A. Jurkat 细胞系 V 区种类频率; B. Ramos 细胞系 V 区种类频率
混合 DNA 样本 (Promega, G1471) 和 WBC RNA 样本中，可检测倒众多的克隆型种类，反映出 IGTR Panel 完全有能力捕获复杂多变重组类型的免疫组库序列 (图4.)。
图4. 其它参考品克隆型频率分布：A. 混合 DNA 样本 (Promega) V-J pair 种类频率；B. WBC RNA 样本的 V-J pair 种类频率
不同人类个体在免疫多样性组合分布上存在一定的个性化特征，但如果长期保持一种单调分布模式，即少部分组合占比特别高，则可能提示个体免疫系统功能的整体水平较低。反之，若频度丰富，则提示个体免疫系统功能的整体水平较高。基于124 例真实样本的 IGTR Panel 捕获结果，我们使用 VDJtools 计算样本 TCR/BCR 多样性指标：香农韦弗指数(Shannon Wiener Index) 和倒转辛普森指数 (Inverse Simpson Index)。如图5. 所示，病例样本与对照组相比，存在一定差异。在免疫治疗过程中，可以结合香农韦弗指数和倒转辛普森指数，预测和评估免疫检查点抑制剂 PD1/PDL-1/CTLA4 等治疗应答的效果。
图5. 124 例真实样本的香农韦弗指数和倒转辛普森指数
注：CTR, Control；CPC, Clinical Pathological Case
V-(D)-J 基因片段被重新排列，其配对频率反应该排列方法在细胞内的丰度，每一个样本的 V-J 组合种类和频率均有所不同。针对病例组与对照组，各组每种 V-J pair 的平均频率的统计结果如图6. 所示。不难发现：不论是 TRB 还是 IGH，两组间均有频率分布上的差异。病例组和对照组存在显著差异的 V-J 组合，可以进行追踪研究，探索作为该种疾病的生物标志物的可能性。
图6. 124 例真实样本的 V-J pair 平均频率统计
在参考品分析中，V-J pair 重组配对种类频率可用来展示 TRB 和 IGH 重组多样性。当针对群体免疫组库的多样性分析时，我们可以将不同个体的 V 和 J 区不同克隆丰度做成矩阵热图。通过 V/J 区丰度热图就可以看出群体中最常见的 V/J 重组的类型，直观的展示不同组间样本群体 V/J 重组配对的差异 (图7.)。
图7. 124 例真实样本的 TRB/IGH 分析：A. V 区丰度热图；B. J 区丰度热图
CDR3 区的克隆型改变标志着 T/B 细胞对某一抗原发生了特异性应答。这种 CDR3 区长度和序列变化，也用于评估 T/B 细胞的功能及免疫应答状态。借助 VDJtools 中的 PlotQuantileStats 命令，即可绘制三层的甜甜圈图来展示克隆型分布情况 (图8.)。最里层的 1、2 和 3+ 分别表示只出现一次的克隆、出现两次的克隆和多次出现的克隆占比情况。单次克隆和两次克隆是评估样本 TCR/BCR 多样性的重要因素。在全血样本中，单克隆型数量与初始 T 细胞有很强相关性，而初始 T 细胞的多样性是免疫组库多样性的重要支柱。中间层的 Q1 (前 20%)、Q2 (接下来 20%)......到 Q5 (后 20%) 分别表示多次出现的克隆 (3+) 中 5 分位分布情况。最外层则为出现次数最多的前 5 个克隆蛋白序列信息。
图8. 124 例真实样本的 CDR3 克隆型甜甜圈图
图9. 124 例真实样本的 CDR3 序列分析统计：A. CDR3 序列长度分布；B. 高频 CDR3 序列分布；C. 高丰度 (Top5) CDR3 序列长度分布
纳昂达推出的 IGTR Panel 可以用于 DNA 或 RNA 样本的 TCR/BCR 的捕获和测序分析，从而获得个体全面的免疫组库信息。对随疾病发生过程而变化免疫组库分析，在自身免疫疾病、肿瘤细胞免疫、抗体疫苗评估、T 细胞免疫疗法等领域研究中都起着重要作用。
本文中通过 IGTR Panel 捕获测序数据的生信分析，展示了从免疫组库克隆的鉴定 (MiXCR) 到高级多样性分析及其可视化 (VDJtools) 的一系列结果。真实样本队列研究的结果，包括 TCR/BCR 的重组多样性统计、V-J Pairing 的不同克隆丰度频率、V/J 重组区域丰度热图和 CDR3 长度分布等一系列重要的免疫组库评价的重要指标，都会对临床和科学研究带来极大的便利和促进作用。
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参考文献：
[1] Bolotin D A, Poslavsky S, Mitrophanov I, et al. MiXCR: software for comprehensive adaptive immunity profiling[J]. Nature methods, 2015, 12(5): 380-381.
[2] Shugay M, Bagaev D V, Turchaninova M A, et al. VDJtools: unifying post-analysis of T cell receptor repertoires[J]. PLoS computational biology, 2015, 11(11): e1004503.
